Применение селекции для получения промышленных штаммов микроорганизмов

Как известно, изменения  скорости биохимических реакций  у бактерий может осуществляться по крайней мере двумя путями. Один из них очень быстрый (реализующийся  в течение секунд или минут) заключается  в изменении каталитической активности индивидуальных молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в  течение многих минут), состоит в  изменении скоростей синтеза  ферментов. В

обоих механизмах используется единый принцип управления системами  – принцип обратной связи, хотя существуют и более простые механизмы  регуляции активности метаболизма  клетки.

Самый простой способ регуляции любого метаболического  пути основывается на доступности субстрата  или наличии фермента. Действительно, снижение количества субстрата (его  концентрации в среде) приводит к снижению скорости потока конкретного вещества через данный метаболический путь. С другой стороны, повышение концентрации субстрата приводит к стимулированию метаболического пути. Поэтому, независимо от каких-то иных факторов, наличие (доступность) субстрата следует рассматривать как потенциальный механизм любого метаболического пути. Иногда эффективным средством повышения выхода целевого продукта является увеличение концентрации в клетке какого-либо определенного предшественника.

Аналогичный эффект может быть получен и в результате повышения концентрации ферментов, что достигается, например, амплификацией генов, контролирующих синтез соответствующего фермента. Наиболее распространенным способом регуляции активности метаболических реакций в клетке является регуляция по типу ретроингибирования.

Биосинтез многих первичных  метаболитов характеризуется тем, что при повышении концентрации конечного продукта данного биосинтетического пути угнетается активность одного из первых ферментов этого пути.

Впервые о наличии  такого регуляторного механизма  было сообщено в 1953 г. A. Novik и L. Szillard, исследовавшими биосинтез триптофана клетками E. coli. Заключительный этап биосинтеза данной ароматической аминокислоты состоит из нескольких, катализируемых индивидуальными ферментами стадий. Указанными авторами было обнаружено, что у одного из мутантов E. coli с нарушенным биосинтезом триптофана добавление данной аминокислоты (являющейся конечным продуктом этого биосинтетического пути) резко тормозит накопление одного из предшественников – индол глицерофосфата в клетках. Уже тогда было высказано предположение, что триптофан ингибирует активность какого- то фермента, катализирующего образование индол глицерофосфата.

Несколько позднее  было четко установлено, что таким чувствительным к триптофану ферментом является антранилатсинтетаза, которая катализирует более раннюю реакцию триптофанового пути – образование антранилата из хоризмата и глутамина. Этот факт был экспериментально обоснован в опыте, когда добавление триптофана в клеточные экстракты E. coli, содержащие фермент антранилатсинтетазу и его субстраты (хоризмат и глутамин), приводило к резкому ингибированию образования антранилата. Более того, было однозначно продемонстрировано, что активность антранилатсинтетазы подавляется только триптофаном и никакие другие метаболиты клетки подобного действия не оказывают. Существует мнение, что регуляция по типу ретроингибирования является общим свойством клеточного метаболизма.

Более тщательное изучения механизма ингибирования активности фермента метаболитами этого же пути, проведенное в условиях in vitro, показало, что метаболит, являющийся ингибитором, специфически связывается с участком молекулы фермента, обладающим высокой степенью сродства к данному ингибитору и абсолютно отличающимся от активного центра фермента (т. е. не перекрывающимся с каталитическим центром). Этот участок получил название аллостерического центра (от греч. "аллос" – другой, "стерос" – пространственный), а сами ферменты, обладающие подобным центром, стали называться аллостерическими ферментами. Аллостерические ферменты представляют собой олигомеры,

состоящие из взаимодействующих  между собой нескольких одинаковых или различающихся субъединиц. При взаимодействии фермента с ингибитором конформация его молекулы изменяется, активный центр при этом также претерпевает изменения, приводящие к утрате каталитической способности фермента. При мутационном изменении аллостерического центра (центра взаимодействия с ингибитором) чувствительность к ингибитору утрачивается и фермент сохраняет свою активность, обеспечивая требуемый для синтеза конечного продукта этап биосинтетического пути.

Зная точно механизм регуляции синтеза интересующего  продукта, и то, участвует ли в регуляции механизм ретроингибирования, можно пытаться получить более активный продуцент данного соединения. Для отбора таких продуцентов используют структурные аналоги метаболитов, по отношению к которым селектируют резистентные варианты.

Например, 5-метилтриптофан, аналог триптофана, так же как и триптофан, ингибирует активность антранилатсинтетазы, но не заменяет собой триптофан в клеточном метаболизме, т. е. не способен включаться в клеточные белки без потери последними биологической активности.

Вследствие этого  данный структурный аналог необходимого метаболита задерживает рост бактерий, если он добавлен в питательную среду.

Некоторые мутанты, устойчивые к ингибирующему действию 5-метилтриптофана, способны синтезировать  значительные количества триптофана и выделять его во внешнюю среду, а антранилатсинтетаза у них оказывается нечувствительной к триптофану, т. е. не подвержена ретроингибированию этой аминокислотой. Такой методический прием часто используется в селекции продуцентов аминокислот, нуклеотидов и витаминов.

Если же необходимо добиться накопления (продукции) какого-нибудь промежуточного продукта биосинтетического  пути, то следует получить мутант с блокированным за этим продуктом этапом. Такой

мутант будет  зависимым от наличия в среде  выращивания вещества, являющегося продуктом заблокированного этапа, либо конечного продукта данного биосинтетического пути.

Давно установлено, что из тысяч ферментов, синтезируемых растущими клетками, одни образуются постоянно и независимо от состава питательной среды, в то время как другие появляются лишь тогда, когда в среде присутствует субстрат их действия. Первые называются конститутивными ферментами (это ферменты гликолиза и др.), вторые относятся к адаптивным или индуцибельным ферментам. Так, клетки E.coli, растущие на среде с глюкозой, обладают следовыми количествами ферментов метаболизма лактозы, а также многих других источников углерода, которые способны усваивать клетки данного микроорганизма.

Но если эти же клетки перенести на среду с лактозой, являющейся в данном случае единственным источником углерода и энергии, то уже через 1–2 минуты можно зарегистрировать повышение активности β-галактозидазы, ключевого фермента в утилизации лактозы. Этот фермент гидролизует лактозу до глюкозы и галактозы. В течение следующего непродолжительного периода (равного 20–180 минутам) активность β-галактозидазы повышается примерно в 1000 раз по сравнению с исходным уровнем. Иными словами, имеет место выраженная индукция фермента, которая может быть определена следующим образом:

Индукция  фермента – это относительное увеличение скорости его синтеза в ответ на появление в среде культивирования определенного химического соединения, называемого индуктором. Часто великолепными индукторами являются неутилизируемые аналоги субстратов. Например, для β-галактозидазы таким веществом служит изопропил-β-D-тио-галактопиранозид (ИПТГ) неметаболизируемый аналог лактозы. С другой стороны, не всегда субстрат является индуктором синтеза

соответствующего  ему фермента. Так, лактоза, прежде чем  выступить в роли индуктора, должна сначала превратиться в свой изомер аллолактозу (под действием β-галактозидазы).

Механизм генетической регуляции процесса индукции ферментов был расшифрован в экспериментах на кишечной палочке при изучении синтеза  фермента утилизации лактозы - β-галактозидазы.

В 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно на основании результатов генетического и биохимического изучения процесса утилизации лактозы бактериями E.coli К 12 сформулировали концепцию, получившую широкую

известность как "модель оперона".

В соответствии с  этой моделью данная система регуляции состоит из четырех компонентов: структурных генов (детерминирующих структуру ферментов), гена-регулятора, оператора и промотора. Ген-регулятор определяет структуру белка-репрессора, способного связываться с оператором, который, в свою очередь, контролирует функционирование прилежащих к нему структурных генов.

Промотор представляет собой область для связывания с ферментом транскрипции – РНК-полимеразой. Если белок-репрессор связан с оператором, то РНК-полимераза не может перемещаться на промотер и синтез информационной РНК не может осуществляться. Результатом является отсутствие синтеза соответствующих ферментов. Первым из подробно изученных оперонов является лактозный оперон кишечной палочки. Авторы концепции предположили, что репрессор является аллостерическим белком, обладающим двумя специфическими центрами, один из которых характеризуется сродством к нуклеотидной последовательности области оператора, а другой – к молекуле индуктора.

Взаимодействие  индуктора с репрессором снижает  сродство последнего (вследствие изменения центра связывания с оператором) к оператору, результатом чего является освобождение оператора. Репрессор lac-

оперона выделен  в чистом виде и состоит из четырех  идентичных субъединиц (общая молекулярная масса равна 150 000 дальтон). Каждая субъединица взаимодействует с одной молекулой индуктора (т. е. требуется четыре молекулы индуктора, чтобы инактивировать репрессор).

Репрессор в чистом виде характеризуется исключительно  высоким сродством к оператору и эффективно связывается с нуклеотидной последовательностью lac-оператора в условиях in vitro. В присутствии индуктора связывание нарушается. Изложенные результаты выполненных экспериментов являются веским подтверждением гипотезы Жакоба и Моно, которая в настоящее время считается полностью доказанной.

Известно, что мутации  в последовательностях гена-регулятора или оператора приводят в определенных случаях к нарушению либо образования полноценного репрессора, либо к нарушению его сродства к оператору. И в том, и в другом случае потребность в индукторе для запуска синтеза информационной РНК, а следовательно, и соответствующих ферментов, исчезает. Подобные мутанты (или мутации) называются конститутивными, поскольку синтез ферментов осуществляется постоянно. Получение конститутивных мутантов имеет важное значение в селекции определенных штаммов промышленных

микроорганизмов.

Концепция оперона  применима и к процессу репрессии  ферментов. Отличием от индуцибельных систем в данном случае является наличие в таких оперонах не активного репрессора (апорепрессора), который в одиночку не способен взаимодействовать с оператором, но может активироваться конечным продуктом (корепрессором) с образованием активного репрессора.

Уже отмечалось, что  с помощью аналога триптофана (5-метилтринтофана) можно получить устойчивые к ингибирующему действию триптофана мутанты, характеризующиеся повышенной продукцией данной аминокислоты. У некоторых из этих мутантов нарушен процесс ретроингибирования антранилатсинтетазы; у других – координированно дерепрессированы ферменты пути биосинтеза триптофана (т. е. ферменты триптофанового оперона). Генетический анализ показал, что у таких мутантов поврежден ген-регулятор, располагающийся на значительном расстоянии от контролируемых им генов триптофанового оперона. Такие мутанты являются конститутивными вследствие либо полного отсутствия репрессора, либо в результате невозможности последнего активироваться триптофаном.

Таким образом, изменяя  регуляцию индуцибельных и репрессибельных оперонов, существует возможность повышать продукционную активность определенных промышленных штаммов- продуцентов. Уместно отметить, что структурные гены одного метаболического пути не всегда объединены в единый оперон (наподобие лактозному), однако это не мешает их регуляции с помощью индукции или репрессии. Так, например, гены E.coli, детерминирующие структуру ферментов, обеспечивающих биосинтез аргинина, располагаются в различных областях хромосомы, но все контролируются одним и тем же геном-регулятором. Такая система образует регулон. Другим показательным примером является SOS-регулон, гены которого детерминируют структуру более десятка различных белков и ферментов, участвующих в репарации повреждений ДНК клетки. Все эти структурные гены регулируются одним репрессором – продуктом гена lехА. Опероны и регулоны, контролирующие взаимосвязанные физиологические функции обнаружены у всех генетически изученных видов бактерий.

Очень важным регуляторным элементом любого оперона является область ДНК, именуемая промотором. Этот участок оперона обеспечивает взаимодействие (связывание) с РНК-полимеразой для начала транскрипции (т. е. синтеза молекулы информационной РНК). От особенностей промотора зависит эффективность транскрипции. Мутации в области промотора, изменяя его активность, могут повышать или понижать экспрессию оперона. Данное свойство промоторов также используется в создании более активных продуцентов. Большие перспективы в селекции продуцентов открывает генетическая инженерия, методы которой позволяют заменять регуляторные области катаболических оперонов на более эффективные промоторы, повышающие продукцию клетками биологически активных веществ и обеспечивающие новые возможности контроля активности генов.