Методы приготовления препаратов хромосом

Методы приготовления  препаратов хромосом

До 1959-1960 гг. получение качественных препаратов хромосом для проведения цитогенетического анализа представляло существенную проблему, поскольку для этой цели было необходимо исследовать клетки тканей, обладающих высокой пролиферативной активностью, например кроветворной ткани костного мозга. К началу 60-х годов XX столетия усилиями нескольких исследователей был разработан достаточно эффективный метод получения препаратов хромосом из лейкоцитов периферической крови человека. В 1959 году Хангерфорд с соавторами (Hungerford et al.) предложили метод краткосрочного культивирования клеток периферической крови человека in vitro, а в 1960 году Ноуэлл и Хангерфорд (Nowell, Hungerford) предложили применение в качестве митогена (стимулятора клеточного деления.) выделенный из семян фасоли мукополисахарид фи-тогемагглютинин (ФГА), позволивший индуцировать in vitro деление покоящихся Т-лимфоцитов периферической крови. В том же 
году Мурхед с соавторами (Moorhead et al., 1960) предложили высушивать на воздухе раскапанную на предметные стекла клеточную суспензию делящихся клеток, что привело к созданию удобного цитогенетического метода, пригодного для диагностических целей.

По мере развития цитогенетики арсенал используемых методов непрерывно пополнялся. К настоящему времени, возможно изучение всего хромосомного набора, отдельных хромосом и их участков в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии клеточного цикла, в 
митозе и мейозе.

В зависимости от степени  пролиферативной активности клеток разных тканей in vivo и in vitro различают прямые и непрямые методы получения препаратов хромосом.

1) Прямые методы используются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, хорион и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непосредственно из свежеполученного материала после специальной обработки.

2) Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования в течение различного периода времени.

Существует множество  модификаций прямого и непрямого  методов приготовления хромосомных препаратов, однако основные этапы получения метафазных пластинок остаются неизменными:

1. Использование колхицина (колцемида) - ингибитора образования митотического веретена, который останавливает деление клеток на стадии 
метафазы.

2. Гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и 
снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хромосом друг от друга, 
способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках.

3. Фиксация клеток с использованием ледяной уксусной кислоты и этанола (метанола) в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способствует 
сохранению структуры хромосом.

4. Раскапывание суспензии клеток на предметные стекла.

5. Окрашивание хромосомных препаратов.

В зависимости от стадии клеточного цикла, в которой находится  исследуемая клеточная популяция возможно проведение следующих цитогенетических исследований:

- анализ отдельных хромосом и их участков в интерфазных ядрах (половой хроматин в ядрах буккального эпителия, оценка анеуплоидии, а также наличия или отсутствия относительно протяженных участков ДНК в интерфазных ядрах любой ткани методом FISH-анализа);

- профазных хромосом (анализ на стадии пахитены в сперматогенезе); 
- прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения);

- метафазных хромосом (традиционный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи, клеток костного мозга, амниотической жидкости);

- стадий анафазы-телофазы (для регистрации специфического воздействия различных мутагенных воздействий) 

Международная система  цитогенетической номенклатуры хромосом человека и этапы ее развития

В 1960 году в американском городе Денвере была создана первая Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека (Ап International System for Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN), обеспечившая международную стандартизацию исследований хромосом еще на начальных этапах становления цито-генетики человека. Хромосомный набор или кариотип человека включает 46 хромосом – 22 пары аутосом и 1 пару половых хромосом (XX - у лиц женского пола и XY - мужского).

В основу Денверской классификации хромосом была положена их морфологическая характеристика: размер, форма и положение первичной перетяжки - центромеры. Согласно данной номенклатуре хромосомы нумеруются от 1 до 23 по мере убывания их длины: с 1 по 22 - аутосомы, а 23 пара - половые хромосомы. Самые крупные хромосомы человека, имеющие первые номера, в среднем 5 раз длиннее самых мелких - 21 и 22 
хромосом. В соответствии с положением центромеры хромосомы принято делить на 3 группы: метацентрические (центромера расположена в середине хромосомы), субметацентрические (центромера смещена от центра хромосомы) и акроцентрические (центромера расположена в дистальной части хромосомы).

Все аутосомы согласно Денверской классификации были подразделены на 7 групп - от А до G. Группа А (хромосомы 1-3) – большие метацентрические хромосомы. Группа В (хромосомы 4 и 5) - включает большие субметацентрические хромосомы. Группа С (хромосомы 6-12) - среднего размера субметацентрические хромосомы. Группа D (хромосомы 13-15) - большие акроцентрические хромосомы. Группа Е (хромосомы 16- 
18) - включает короткие субметацентрические хромосомы. Группа F - (хромосомы 19 и 20) - маленькие ме-тацентрические хромосомы. Группа G -(хромосомы 21 и 22) - включает малые акроцентрические хромосомы. Половая Х-хромосома по длине и центромерному индексу (соотношению между длиной короткого и длинного плечей хромосомы) близка к хромосомам группы С, а Y-хромосома по величине и морфологии (при обычной 
окраске) близка к хромосомам группы G.

В дальнейшем номенклатура хромосом человека получила развитие на последующих международных цитогенетических конференциях в Лондоне (1963 г.) и Чикаго (1966 г.). Однако большой прогресс, достигнутый благодаря внедрению методов дифференциальной окраски, потребовал существенного дополнения данной номенклатуры новыми принципами анализа сегментированных хромосом. В1971 году в Париже на IV 
международном конгрессе по генетике человека была согласована единая система идентификации хромосом человека, учитывавшая дифференцировку хромосом по длине.

Каждая хромосома набора человека при дифференциальной окраске  характеризуется уникальным для нее сочетанием темно окрашенных сегментов или полос (англ. - band), чередующихся с неокрашенными участками или светлыми сегментами. Именно такое специфическое для данной хромосомы сочетание сегментов позволяет четко ее идентифицировать и отличить от других хромосом набора. В пределах короткого (р) и длинного (q) плеча каждой хромосомы выделяют ряд четко идентифицируемых областей или регионов (англ. - region), которые нумеруются арабскими цифрами начиная от центромеры (сеп) к теломерному (tel) участку или терминальному (ter) концу хромосомы. Каждая область хромосомы включает определенное число сегментов, нумерация которых (второй арабской цифрой) также идет в направлении от центромерного к теломерному участку. Таким образом, обозначение хромосомного сегмента 2q34 означает хромосому №2, длинное плечо, 3 регион и 4 сегмент. 
Сама центромера обозначается сочетанием цифр 1 и 0, т.е. часть центромеры в пределах короткого плеча обозначается как- р10, а часть, включающая длинное плечо -q10.

Открытие в середине 70-х  годов того факта, что профазные и про-метафазные хромосомы позволяют достичь большего числа сегментов, чем метафазные хромосомы, и, следовательно, повысить разрешающие возможности цитогенетического исследования, привело к разработке методов получения хромосом высокого разрешения и потребовало дополнения цитогенетической номенклатуры новыми принципами анализа таких хромосом. В1980 году по этому поводу в Париже было достигнуто международное соглашение, которое было опубликовано в 1981 году под названием "Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека - сегментация хромосом высокого разрешения" или ISCN(1981). Так, если сегмент в пределах какой-либо хромосомы подразделяется на отдельные субсегменты, то после номера сегмента ставится точка, после которой указывается номер субсегмента. Например, если оригинальный сегмент 1 р31 подразделяется на 3 разных субсегмента, то они 
обозначаются как 1р31.1, 1р31.2и 1р31.3, причем субсегмент 1р31.1 является проксимальным, а 1 р31.3 - дистальным по отношению к центромере. Дополнительное деление субсегментов на другие сегменты, например субсегмента 1 р31.1, соответственно обозначается как 1р31 .11 -1р31 -12 и т. д.

В1985 году была опубликована цитогенетическая номенклатура, учитывающая новую терминологию для характеристики приобретенных конституциональных хромосомных нарушений, выявляемых в опухолевых клетках- ISCN (1985). В 1991 году Международным комитетом по стандартизации цитогенетических исследований было опубликовано скорректированное "Руководство по цитогенетике рака" - ISCN (1991). Однако 
прогресс, достигнутый в дальнейшем благодаря использованию нового метода молекулярной цитогенетики -флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), потребовал дополнения цитогенетической номенклатуры новыми принципами молекуляр-но-цитогенетического анализа хромосомных нарушений. Такой документ по стандартизации цитогенетических исследований, отражающий последние достижения в этой области, был 
опубликован в 1995 году-ISCN (1995).

Дифференциальная  окраска хромосом

В зависимости от целей  цитогенетического исследования используются различные методы окрашивания хромосом. Наиболее распространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G-, С-, R- и NOR- или Ag-окраска. В свою очередь, методы дифференциального окрашивания делятся на 2 группы: 1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты); 2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты).

Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окрашивания  полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азур-эозином), без какой-либо их предварительной обработки. Такая окраска приводит к сплошному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы набора. Исторически рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959-1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность.

Q-окраска (от англ. Quinacrine - акрихин) выявляется на хромосомах в виде чередования ярко- и темно-флюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителями) как производные акридина - акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присоединяться к ДНК путем интеркаляции 
или с помощью внешних ионных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ) по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека принадлежит шведскому цитогенетику Касперссону (1970). 
В популяциях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдельных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски-Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светящихся сегментах, локализованных в центромерных участках (сеп) хромосом 3 и 4, а также в коротких плечах (р11) и спутниках (р13) всех акроцентрических хромосом человека 13-15,21 и 22. Кроме того, у лиц мужского пола ярко 
флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы У - сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все перечисленные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются областями локализации гетерохроматина - некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК, вариабельность которых не приводит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть использованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских проблем.

G-окраска (от англ. Giemsa- Гимза) выявляется благодаря предварительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске красителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гетерохроматиновым районам, а светлые-эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой лаборатории эмпирическим путем. 
Методика G-окраски хромосом человека была впервые предложена английской исследовательницей Мариной Сибрайт (Seabright) в 1972 году и практически в неизменном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски аналогичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам.

Различия состоят в том, что:

 а) несветящиеся гетерохроматиновые  центромерные сегменты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гимза; 
б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3,4,13-15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске.

На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется около 320 сегментов на гаплоидный геном.

R-окраска (от англ. Reverse - обратная) отличается противоположностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми - гетерохроматиновые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каждый из них имеет свою кодировку по международной цитогенетической номенклатуре. Наиболее приемлемой является обработка препаратов Ва(ОН)₂ с прогреванием их при 60°С и последующей отмывкой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом - RHG.

С-окраска (от англ. Constitutive heterochromatin - конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине тем-ноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицен-тромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые участки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С- окраски могут варьировать, но важным условием является предварительная обработка препаратов щелочью с последующей двухчасовой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе (2 X SSC) при 65°С. В качестве щелочных растворов обычно применяют гидрат окиси бария или натрия. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (CBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повторяющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хроматина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашива-ния, существует межиндивидуальная вариабельность по определенным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-гетерохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом).