Механизмы выживания бактерий в окружающей среде

Заряженная внутриклеточная среда также имеет важное значение для выживания облигатных и кальдоактивных термофилов благодаря тому, что она может стабилизировать некоторые ферменты, обнаруживающие более низкую термостабильность при оптимальной или максимальной температуре роста.

Концепция стабилизации белков in vivo посредством заряженных макромолекул принята в качестве правдоподобного объяснения механизма термофилии у В. coagulans по следующим причинам:

1) в неочищенных экстрактах клеток, выращенных при любой из двух указанных температур, присутствуют заряженные макромолекулы, которые, однако, из-за разбавления в условиях in vitro не могут полностью проявить своего защитного действия на ферменты. Тем не менее имитация существующей в условиях in vivo заряженной среды путем добавления к клеточным экстрактам (NH4)2S04 или NaCl приводит к полному предохранению фермента от инактивации;

2) в случае очищенной до кристаллического состояния ГФДГ, т. е. в условиях, когда отсутствует взаимодействие фермента с другими макромолекулами, заряд сам по себе стабилизирует фермент;

3) микробная клетка представляет собой высокоорганизованную систему, содержащую лишь незначительное количество свободной внутриклеточной воды, таким образом высокозаряженные макромолекулы играют важную роль в механизме термостабилизации белков в интактной клетке. В условиях in vivo заряд макромолекул достаточен для стабилизации относительно термолабильных ферментов облигатных и кальдоактивных бактерий (Кашнер Д.,1981)

3. МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ  БАКТЕРИЙ ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ЗНАЧЕНИЯХ  РН

Давно установлено, что концентрация водородных ионов  играет роль фактора, определяющего границы существования живой матери, и является одним из важнейших факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов. Концентрация водородных ионов воздействует на ионное состояние, а следовательно, и на доступность для организма многих метаболитов и неорганических ионов: с одной стороны, концентрация ионов водорода непосредственно влияет на клетку, ее электрический заряд, состояние мембраны, возможность протекания окислительно-восстановительных реакций, с другой стороны, — косвенно, определяя ионное состояние металлов, кислот, их доступность и токсичность. Невозможно переоценить ее влияние на стабильность и функции макромолекул в биологических процессах. Значения реакции среды различных природных вод и растворов, где развиваются микроорганизмы (от рН 1 — 2 в кислых источниках и рудничных стоках до рН 10 в содовых озерах), покрывают почти весь теоретически возможный диапазон значений рН (0— 14). Большая часть организмов наилучшим образом развивается при концентрации ионов водорода, близкой к рН=7, что характерно для многих природных сред. Очень высокие (кислая реакция) или очень низкие (щелочная реакция) концентрации водородных ионов обычно токсичны для большинства организмов. В общем, предельные концентрации ионов водорода, выше и ниже которых известные в настоящее время организмы прекращают рост и размножение, приблизительно равны рН=1, что отмечено лишь для немногих бактерий и грибов, и рН=11, что наблюдается в случае некоторых водорослей, грибов и бактерий. Большинство организмов живет при рН от 4 до 9, причем их оптимальный рост наблюдается в среде, близкой к нейтральной.

Каждому микроорганизму свойствен определенный интервал кислотности  или щелочности среды, в котором  возможен его активный рост. В зависимости  от положения оптимального рН развития различают ацидофильные, нейтрофильные и алкалифильные микроорганизмы. Большинство естественных местообитаний имеет нейтральный или близкий к нему (слабокислый или слабощелочной) рН. Так, если рН пресной воды равен 7,0, то реакция морской воды скорее слабощелочная (рН 7,5 — 8,0).

В почве рН может  быть достаточно низким, до 4,0. В таких  местообитаниях развиваются организмы, называемые алкали - или ацидотолерантными  и умеренными алкали- или ацидофилами. Тем не менее встречаются как  природные, так и антропогенные местообитания, которые можно отнести к экстремальным: экстремально кислые с рН < 4,0 и экстремально щелочные с рН >10,0. Развивающиеся там микробные сообщества представлены соответствующими экстремофильными микроорганизмами. Примером ацидофилов служат молочнокислые, уксуснокислые бактерии, многие грибы (Бухарин О.В., 2005).

Меньше примеров алкалифильных организмов, требующих  для своего роста значений рН до 10 и выше (уробактерии и многие цианобактерии). Среди бактерий обнаружено несколько видов, устойчивых к щелочной среде (рН 8,5 и выше). Сюда следует отнести Bacillus pasteurii — бактерию, расщепляющую мочевину и хорошо растущую при реакции среды, близкой к рН 11. В. alcalophilus, выделенная из сточной воды, способна расти в диапазоне рН 9—11,5. Выделены и другие бациллы, очень устойчивые к щелочной среде. Цианобактерии могут развиваться в природной среде с рН 7,5—10, некоторые из этих бактерий имеют оптимум рН 10 (Покровский В.И., 1999).

Природные среды, имеющие рН, близкий к обычному нижнему пределу (3—4), встречаются довольно часто. Однако среды с рН более низким, чем 3—4, чрезвычайно редки. Примерами среднекислых сред обитания служат многие озера, некоторые истощенные почвы и кислые болота. Такие естественные среды обеспечивают развитие многих эукариотических водорослей, бактерий, растительных и животных форм. Из этих сред было выделено множество малоизвестных бактерий: Bactoderma, Caulobacter, Microcyclus, Planctomyces и Thiovobium, обнаруженных в сфагновых болотах с рН от 3 до 5. Представители уксуснокислых бактерий растут в пределах рН от 3 до 5. Интересным примером является Acetobacter acidophilum prov. sp., у которого оптимум роста находился при рН 3, нижний предел роста при рН=2,8, а верхний—при рН=4,3.

3.1 Основные механизмы выживания

Концентрация водородных ионов в окружающей среде оказывает целый ряд прямых и косвенных воздействий на метаболизм и стабильность клетки. себе Ионы водорода (Н+) обладают уникальными свойствами, отличающими их от других катионов. Они представляют собой протоны, лишенные электронов. В водных растворах они быстро гидратируются и образуют ион гидроксония Н30+. В кислой среде преобладают ионы гидроксония, которые реально существуют в форме гидратированных ионов, причем степень гидратации зависит от концентрации ионов гидроксония и температуры.

Микроорганизмы, обладающие способностью расти и размножаться при низких или высоких значениях рН, имеют определенные механизмы, обеспечивающие их выживание. Преимуществом данных микроорганизмов является то, что при таких условиях резко ограничивается конкуренция других организмов. Например, ацидофил Thiobacillus thiooxidans может использовать в кислой среде ионы двухвалентного железа, которые при рН выше 5 самоокисляются, вследствие чего этот производящий энергию субстрат становится недоступным для данного организма. При высоких значениях рН алкалофил Bacillus pasteurii специфически нуждается в аммиаке для транспорта и окисления таких субстратов, как глутаминовая кислота, изолейцин, треонин, а также промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот — ацетата, а-кетоглутарата и малата. В этом случае преимущество существования В. pasteurii при высоких значениях рН заключается в том, что щелочная среда обеспечивает доступность NH3 для организма.

Изменения рН окружающей среды могут вызывать у многих микроорганизмов компенсаторные ферментативные сдвиги. Например, Escherichia coli реагирует на повышение кислотности среды синтезом декарбоксилаз аминокислот. Образующиеся в результате амины приводят к снижению кислотности среды. Повышение щелочности среды стимулирует образование дезаминаз аминокислот, что приводит к снижению рН. Большинство активно метаболизирующих щелочеустойчивых организмов имеет склонность к снижению рН среды в процессе роста. Такая реакция является вторичным механизмом устойчивости микробных клеток к щелочной среде. Пока неизвестно, каков первичный механизм, обеспечивающий стабильность клеток и их рост при высоких значениях рН. Большинство облигатных ацидофилов не использует такого вторичного механизма устойчивости, поскольку их активный рост не приводит к повышению рН. В тех случаях, когда рост ацидофилов начинается в среде, близкой к нейтральной, величина рН быстро снижается. Экстремальные ацидофилы не просто переносят низкие значения рН, но действительно нуждаются в ионах водорода для своего роста и стабильности. Примером подобных микроорганизмов служит Т. acidophilum, которая лизируется при рН выше 5. Следовательно, устойчивость клеток к высокой кислотности или щелочности, вероятно, объясняется их структурными или метаболическими особенностями (Кашнер Д., 1981).

Внутриклеточный рН экстремальных  ацидофилов обычно не ниже 4,5. Транспорт  ионов и синтез АТФ управляются  протонной помпой. Внеклеточные белки  экстремальных ацидофилов отличаются высокой стабильностью по отношению к кислотам, в то время как внутриклеточные имеют нейтральный или слабокислый оптимум активности. Вместе с тем нейтральный рН часто бывает токсичным для клеток экстремальных ацидофилов. Возможно, это связано с нарушением целостности цитоплазматической мембраны, для стабильности которой требуются высокие концентрации ионов водорода.

Внутриклеточный рН экстремальных  алкалифилов также достаточно высок, однако не превышает 9,5. Белки экстремальных  алкалифилов обладают большой алкалистабильностью, а также имеют оптимум активности при щелочных значениях рН. Благодаря этому протеазы, липазы и целлюлазы из алкалифильных микроорганизмов широко используют при производстве детергентов. Транспортные процессы в клетках алкалофилов и движение клеток основаны на градиенте Na⁺, однако синтез АТФ происходит за счет функционирования протонной помпы.

У облигатных алкалофилов  в поддержании цитоплазматического  рН, более низкого по сравнению  с наружным, ведущая роль принадлежит  Na⁺/Н⁺- антипортеру, катализирующему движение внутрь клетки протонов в обмен на ионы натрия, в которых эти бактерии нуждаются. В любом случае основными барьерами, обеспечивающими необходимый рН у облигатных ацидо - и алкалофилов, служат клеточная стенка и ЦПМ (Бухарин О.В., 2005).

Жизнедеятельность микроорганизмов часто может приводить к изменению рН среды. Так, к подкислению среды ведут окисление сульфидов до серной кислоты тионовыми бактериями, процессы нитрификации, многие брожения. В некоторых случаях бактерии могут регулировать рН среды за счет изменения метаболизма. Наиболее известным примером является двухфазность брожений, подробно изученная в 30-х годах XX в. В. Н. Шапошниковым на примере ацетонобутилового брожения (Clostridium acetobutilicum). При снижении рН до критического уровня в результате выделения масляной кислоты бактерия переключается на образование нейтральных продуктов, ацетона и бутанола.

К подщелачиванию среды приводят дезаминирование  белков и аминокислот аммонификаторами, разложение мочевины уробактериями, а  также фотоассимиляция С0₂ (так, в часы интенсивного фотосинтеза значение рН воды в фотической зоне водоема может возрастать на 1 — 2 единицы). Стабильное значение рН среды в некоторых местообитаниях связано с ее буферностью. Наибольшие масштабы имеет карбонат/бикарбонатная система, обеспечивающая постоянство рН вод Мирового океана (Заварзин Г.А., 2001).

Все организмы, растущие при экстремальных значениях  рН, располагают, механизмами для  поддержания внутриклеточного рН на уровне, близком к нормальным физиологическим  величинам. Такие кислотолабильные молекулы, как АТР и ДНК, не смогли бы существовать, если бы внутриклеточная концентрация водородных ионов была такой же, как и во внешней среде. Однако по отношению к внутриклеточной среде трудно применить классическую концепцию рН. Согласно этой концепции, рН является применяемым на практике показателем концентрации или активности ионов водорода в водном растворе, между тем как внутриклеточное содержимое представляет собой коллоидный, а не истинный водный раствор. Измерение величины внутриклеточного рН не дает информации относительно недиссоциированных протонов, связанных с донорными молекулами.

Внутриклеточный рН имеет определенную ценность, так как он дает представление об общих условиях, существующих внутри клетки.

В поддержании градиентов рН в клетке важную роль играет как природа клеточной стенки и мембраны, так и клеточный метаболизм.

4. ЖИЗНЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ СОЛЕЙ И РАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И В УСЛОВИЯХ НЕДОСТАТКА ВОДЫ

В живых клетках  вода служит средой, в которой молекулы разных размеров взаимодействуют между собой. Структура воды, в которой находятся растворенные вещества, контролирует все жизненно важные процессы в клетке: действие ферментов и регуляцию их активности, ассоциацию и диссоциацию органелл, структуру мембран и их функционирование. Небольшие изменения в концентрации растворенных веществ и активности воды могут приводить к значительным физиологическим изменениям, поэтому не удивительно, что многоклеточные организмы выработали специальные физиологические механизмы для поддержания постоянного состава не только жидкостей тела, но и внутриклеточной среды. Например, в крови млекопитающих поддерживается равновесие между ионами натрия и калия с помощью сложного гормонального контроля, действующего на уровне почек и основанного на обмене между кровью и тканями.

Однако микробные  клетки должны самостоятельно приспосабливаться  к внешней водной среде. В качестве «экстремальных условий» можно рассматривать  весьма обычные условия, когда клетки растут в растворах, значительно более разбавленных, чем их внутренняя среда, что имеет место у всех пресноводных микроорганизмов. Животные предохраняют от осмотического лизиса клетки своего тела, поддерживая концентрации веществ, растворенных во внеклеточных жидкостях, в соответствии с их концентрациями внутри клеток. Часто их наружный покров совершенно непроницаем для воды. Большинство микроорганизмов покрыто жесткой клеточной стенкой, предотвращающей их лизис в результате высокого осмотического давления, возникающего внутри этих клеток. У простейших, которые имеют более гибкие стенки, проблемы, связанные с высоким осмотическим давлением, решаются другим путем: вода, поступающая в клетки, собирается в сократительные вакуоли, а затем выделяется из них наружу.

Напротив, клетки, растущие при высоких концентрациях растворенных веществ, по-видимому, не способны поддерживать цитоплазму в более разбавленном состоянии. Это было бы возможно только в том случае, если бы клетки были непроницаемы для воды или непрерывно осуществляли активное выделение растворенных веществ. Хотя внутриклеточная среда микроорганизмов по химическому составу сильно отличается от внешней, не известно ни одного вида, который был бы способен поддерживать внутри клеток общую концентрацию растворенных веществ на более низком уровне, чем в окружающей среде (Кашнер Д., 1981).