Механизм интеграции лямбда фага в бактериальную хромосому (сайт-специфическая рекомбинация)

     Содержание 

     1. Механизм интеграции лямбда фага в бактериальную хромосому (сайт-специфическая рекомбинация)…………………………………………......2

     2. Список использованных источников……………………………………6 
Механизм интеграции лямбда фага в бактериальную хромосому (сайт-специфическая рекомбинация) 

     Сайт-специфическая  рекомбинация происходит между специфическими последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15-30 п.н. Она широко распространена у прокариот и низших эукариот. Сайт-специфическая рекомбинация обеспечивает интеграцию (включение) ДНК умеренных  фагов в хромосомы бактерий, инверсию (изменение ориентации) отдельных  участков ДНК в хромосомах бактерий и бактериофагов и в так  называемой 2-микронной плазмиде дрожжей, а также другие процессы, играющие важную роль в циклах развития фагов  и бактерий. Редкий, если не единственный, но зато жизненно важный пример сайт-специфической  рекомбинации у многоклеточных животных – перестройки в последовательностях ДНК, кодирующих иммуноглобулины – белковые молекулы, распознающие тот или иной антиген при иммунном ответе у позвоночных.

     Рассмотрим  некоторые из самых известных  примеров сайт-специфической рекомбинации. Наиболее изучена она у умеренного бактериофага лямбда. После инфекции в клетку E. coli линейная вирионнаядвуцепочечная ДНК фагазамыкается в кольцо за счет имеющихся на ее концах комплементарных одноцепочечных последовательностей. Последующее развитие фага может идти по пути интеграции в хромосому бактерии между генами gal и bio. Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)-сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромосоме бактерии. Интегрированный фаг называется профагом. Он фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы происходит в обратной последовательности событий. В интегративной рекомбинации участвуют сайты attP и attB, продукт фагового гена int (интеграза) и белок IHF (IntegrationHostFactor) E. coli. Для эксцизии необходимы сайты attL и attR, те же белки и еще продукт фагового гена xis. Сайты attP и attB неравноценны. Первый устроен сложно. При размере около 270 п.н. он состоит из центральной части О и двух примыкающих к ней частей: P и P'. Внутри сайта attP располагаются участки связывания с интегразой и белками IHF и Xis. Сайт attB устроен проще. Его размер всего 23 п.н., гомология с attP ограничена центральной частью из 15 п.н., в которой имеются два сайта связывания с интегразой. Интеграза является топоизомеразой типа I, но только сайт-специфической. В результате образования комплекса интегразы с attP-сайтом и белком IHF формируется сложно уложенная нуклеопротеидная структура, которая захватывает сайт attB. В этой структуре последовательности ДНК att-сайтов связываются за счет взаимодействий между субъединицами интегразы и затем подвергаются согласованному расщеплению.

     Как и все топоизомеразы I, интеграза  делает разрыв в одной цепи каждого  дуплекса, и в месте разрыва  образуются 3'-P и 5'-OH-концы ДНК. Фермент  ковалентно связывается с 3'-P-концом, благодаря чему энергия разорванной  фосфодиэфирной связи сохраняется, и для последующего замыкания  разрыва, осуществляемого тем же ферментом, не требуется дополнительной энергии. Этим топоизомеразы отличаются от ДНК-лигаз, использующих для сшивания концов цепей ДНК энергию, освобождающуюся  за счет гидролиза соединений типа АТФ. Поэтому разрыв полинуклеотидной цепи, образуемый топоизомеразой, называют "временным" в отличие от фиксированных  одноцепочечных разрывов, производимых эндонуклеазами. При этом интеграза  может осуществлять рекомбинацию между att-сайтами путем замыкания фосфодиэфирной связи с 5'-OH-концом из другого дуплекса, то есть путем обменов 5'-OH-концами. Такая  рекомбинация между дуплексами, не требующая дополнительной энергии, называется консервативной.

     Основные детали сложного молекулярного процесса интегративной рекомбинации: в упрощенном виде его можно представить следующим образом: сначала интеграза производит обмен между двумя цепями одинаковой полярности. При этом разрыв и воссоединение цепей происходят между строго определенными нуклеотидами в центральной части att-сайтов. В результате возникает структура, физически соответствующая полухиазме Холлидея. Затем на расстоянии 7 п.н. происходит вторая пара обменов между двумя другими цепями, не участвовавшими в первом обмене. Вторая пара обменов приводит к интеграции фага; интегрированныйпрофаг фланкирован рекомбинантными сайтами attL и attR. Предполагается, что для катализа этой реакции необходимы четыре субъединицы интегразы, связанные в att-сайтах.

     Важно отметить, что все изученные ферменты, непосредственно осуществляющие сайт-специфическую  рекомбинацию у фагов и бактерий, а также белок, катализирующий инверсию в 2-микронной плазмиде дрожжей, являются сайт-специфическими топоизомеразами I. По уровню гомологии их аминокислотных последовательностей и механизму  катализирумых реакций их разделяют  на две группы: представителями первой группы являются уже рассмотренная  нами интеграза фага лямбда, интегразы  других умеренных фагов и белок, катализирующий сайт-специфическую  рекомбинацию в плазмиде дрожжей, ко второй относят инвертазы бактерий и фагов и некоторые другие ферменты сайт-специфической рекомбинации.

     Сайт-специфическая  рекомбинация, катализируемая ферментами второй группы, происходит по более  простой схеме, чем в случае интеграз. Рассмотрим ее на примере инвертазы  фага Mu. В центральной части своей  хромосомы фаг содержит особый сегмент G размером около 3 т.п.н. Сегмент имеет  на концах инвертированные (обращенные) повторы длиной около 30 п.н. В каждом повторе, в свою очередь, имеется  специфический рекомбинационный сайт. Инвертаза проводит рекомбинацию между  этими сайтами. Четыре субъединицы фермента, по одной субъединице на каждую цепь ДНК, делают «временные» разрывы в обеих цепях каждого рекомбинационного сайта, то есть одновременно расщепляют все четыре цепи, образуя 5'-P и 3'-OH-концы. При этом разрывы цепей в каждом дуплексе происходят на расстоянии 2 п.н., так что 3'-конец как бы выступает. Фермент ковалентно связывается с 5'-P-концами. Затем одна часть первого дуплекса меняется местами с такой же частью второго дуплекса, после чего восстанавливаются фосфодиэфирные связи во всех четырех цепях.

     Приведенная реакция, как и большинство из процессов, осуществляемых инвертазами  у бактерий кишечной группы и их фагов, входит в особую систему сайт-специфических  инверсий ДНК, получившую название Din (от DNA inversions). Помимо фага Muсайт-специфические  инверсии обнаружены у умеренного фага P1 и энтеробактерий E. coli, Salmonellatyphimurium, Citrobacterfreundii. Инверсии специальных сегментов  хромосом, ограниченных обращенными  повторами ДНК длиной около 30 п.н., происходят с высокой частотой путем  рекомбинации в этих повторах. Меняя  ориентацию определенных генов относительно их промоторов, инверсии приводят к  включению одних генов и выключению других. Это один из примеров регуляции  работы генов путем специфических  перестроек ДНК. Они имеют приспособительное  значение. Например, у S. typhimurium инверсии сегмента H переключают гены H1 и H2, кодирующие разные типы белка флагеллина, из которого построены жгутики, что позволяет  этой патогенной для мышей бактерии менять поверхностный антиген и  тем самым ускользать от действия иммунной системы хозяина. У фагов  инверсии переключают гены, кодирующие разные белки хвостовых отростков, что приводит к смене хозяев – бактерий, в которых может размножаться фаг.

     В качестве конкретного примера вернемся к системе инверсий G-сегмента у фага Mu. Сегмент содержит четыре гена: U, U ', Sv и Sv '. Два последних представлены в сегменте только своими вариабельными частями, тогда как их общая константная часть Sc вместе с промотором P примыкает к сегменту слева. Справа от сегмента G расположен ген инвертазы gin. При одной ориентации сегмента (G+) транскрибируются гены Sv и U, при противоположной ориентации (G-) функционируют гены Sv' и U '. В первом случае фаг размножается на E. coli B, E. coli K12 и S. typhimurium, во втором – наE. coliC, Citrobacterfreundii, Shigellasonneiидр. Следует особо отметить, что все работающие в системе Din инвертазы фагов и бактерий заменяют друг друга в рекомбинации invitro. Это обусловлено их общим происхождением: инвертазы гомологичны между собой на 60-70% и их рекомбинационные сайты в обращенных повторах на концах инвертируемых сегментов также гомологичны.

     Завершая  описание сайт-специфической рекомбинации отметим ее принципиальные отличия  от гомологичной рекомбинации. В случае последней молекулы ДНК узнают друг друга путем прямого сопоставления  их последовательностей через посредство рекомбиназ типа белка RecA. Для этого  в ДНК вводятся специальные пресинаптические повреждения, высвобождающие одноцепочечные участки ДНК, что и лежит в  основе узнавания гомологичных последовательностей. Напротив, при сайт-специфической  рекомбинации главную роль в синапсисе  играет взаимное узнавание белков, связанных с рекомбинационными  сайтами. Эти сайты совсем короткие, и гомология между ними непосредственно  для синапсиса несущественна. Она  важна для связывания со специфическими белками и для обмена цепями между  сайтами. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  использованных источников

     1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и  др. Молекулярная биология клетки: Пер. с англ. М.: Мир, 1994. Т. 1, ч. 2. С. 310-313, 318-324.

     2. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с  основами селекции. М.: Высш. шк., 1983. C. 336-346.

     3. Льюин Б. Гены: Пер. с англ. М.: Мир, 1987. С. 453-476, 490-492.

     4. Хесин Р.В. Непостоянство генома. М.: Мир, 1984. С. 9-52, 105-113, 228-236, 352, 376-378.