Криоконсервация

 

План  реферата

1. Криоконсервация

- температурный  режим

- криоповреждения

- криопротекторы 

2. Криоконсервация спермы

 
 

3. Криоконсервация эмбрионов

 
 

4. Заключение 

 
 

5.      Список используемых источников  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Криоконсервация

   Криоконсервация - процесс хранения органов, тканей или отдельных клеток при пониженной температуре. Наилучшие условия для криоконсервации создаются при температуре жидкого азота, минус 196 градусов Цельсия. Криоконсервация позволяет создать клеточный "банк запасных частей", необходимых для восстановления жизненных функций организма, нарушенных в результате заболевания или в процессе его лечения. Криоконсервации могут быть подвергнуты и стволовые клетки пуповинной крови, полученные при рождении человека. В этих условиях стволовые клетки могут храниться десятилетиями. В последующие годы они могут быть извлечены из криогенного хранилища, разморожены и использованы для новых способов лечения заболеваний. 

Температурный режим

   Как правило, криоконсервацию осуществляют при температуре −196 °C, помещая капсулы с биологическими объектами в жидкий азот. Реже пользуются более высокими температурами (от −180 °C до −130 °C), которые создают электрифицированные морозильные камеры, но данный температурный режим менее надежен и подходит не для всех объектов. Использование температур выше −130 °C малоэффективно и используется редко (например, хранение на сухом льду при −79 °C). Сохранение живых объектов при температурах около нуля градусов традиционно не относят к криоконсервации. Использование низких температур обеспечивает остановку биохимических процессов в клетках, в том числе останавливается обмен веществ и энергией с внешней средой, благодаря этому живые объекты могут сохраняться сколь угодно долго. 

Криоповреждения

   Использование низких температур опасно для живых объектов. Живые клетки погибнут при замораживании, если не осуществить специальные защитные мероприятия. Основными повреждающими факторами при замораживании являются образование внутриклеточного льда и обезвоживание клетки. Образование внутриклеточного льда характерно для большой скорости охлаждения (более 10K/мин). Кристаллизация внутриклеточной воды приводит к увеличению внутреннего объема мембранных структур (ядро, аппарат Гольджи, митохондрии, эндоплазматическая сеть, лизосомы, цитоплазматическая мембрана и пр.) Эти структуры разрушаются. Обезвоживание клетки характерно для небольшой скорости охлаждения (менее 10K/мин). Потеря клеткой воды происходит вследствие вымораживания воды во внешней среде и повышения концентрации растворенных веществ во внешней среде. При охлаждении клетка может потерять до 80-90 % воды, при этом разрушаются гидратированные комплексы с макромолекулами, что приводит к так называемой «криоденатурации» — потере биологическими полимерами (прежде всего белками и белковыми комплексами) третичной и четвертичной структуры, что приводит к необратимой утрате функций этих полимеров. В криобиологии повреждения, получаемые клеткой при замораживании, называют «криоповреждения». 
 
 

Криопротекторы

   Лишь некоторые клеточные культуры, а также бактерии могут быть эффективно криоконсервированы без предварительной подготовки. Для эффективной криоконсервации клетки замораживаемых объектов должны быть насыщены криопротекторами — веществами, уменьшающими криоповреждения. После размораживания необходимо удалить криопротекторы из клеток. 

Криоконсервация спермы

   Криоконсервация – замораживание и хранение живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. За последнее десятилетие в развитии репродуктивной медицины во всем мире отмечается тенденция к криоконсервации яйцеклеток, сперматозоидов, эмбрионов и бластоцист. Метод криоконсервации позволяет сохранять качество биологического материала на протяжении нескольких лет, что достигается благодаря тщательной разработке и изучению методик замораживания и оттаивания. Такой подход обеспечивает большую управляемость и эффективность лечения в преодолении мужского и женского бесплодия.

   В настоящее время криоконсервация спермы при проведении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) применяется в следующих случаях:

1. создание банка донорской спермы;
2. Замораживание является чрезвычайно ценным подспорьем при создании банка донорской спермы: во-первых, дает возможность использовать сперму с нужными характеристиками в любое время и в любом месте, а, во-вторых, позволяет осуществлять двойной контроль доноров в отношении зараженности их спермы вирусами СПИДа и гепатита, что практически исключает опасность инфицирования и женщины, и плода;
3. в случаях, когда в день пункции фолликулов жены невозможно получить сперму мужа для оплодотворения яйцеклеток;
4. перед началом лечения с применением лекарственных средств и технологий, которые могут повлечь за собой ухудшение оплодотворяющей способности спермы (онкологические заболевания, гепатит С и др.);
5. при необходимости концентрации и накопления сперматозоидов при их недостаточном количестве в эякуляте.

   Развитие репродуктивной медицины в начале 90-х годов позволило проводить оплодотворение сперматозоидами пациентов с олигозооспермией, а также сперматозоидами, полученными хирургическим путем у пациентов с азооспермией. При этом количество пригодных для оплодотворения подвижных нормальных сперматозоидов может оказаться крайне малым, а их выделение очень трудоемкое и требует больших усилий и затрат времени. Если существует высокий риск повторного неполучения этого уникального генетического материала или физическая невозможность его получения в последующих попытках, требуется сохранение выделенных единичных сперматозоидов путем криоконсервации. Для пациента такая криоконсервация может быть страховкой от неполучения сперматозоидов непосредственно в день пункции или избавлением от повторной травматичной операции.

   Возможности лечения бесплодия существенно расширились благодаря разработанной технике замораживания сперматозоидов, эмбрионов и яйцеклеток, что сделало процедуру ЭКО значительно более гибкой.

   Выбор оптимального метода замораживания и размораживания спермы и ооцитов зависит от возможностей лаборатории. Перед криоконсервацией спермы обязательно проводится контрольное замораживание/размораживание спермы.

   Результаты контрольного исследования доводятся до сведения пациента/донора. Это необходимо, чтобы иметь гарантию для возможности последующего использования материала.

   Отдельные попытки сохранения в замороженном состоянии яйцеклеток и сперматозоидов животных предпринимались еще 200 лет назад. Но только с 1949 года, когда Польдж с коллегами открыли защитные свойства глицерина, криоконсервация спермы стала реальностью. Криоконсервация не влияет на качество и генетическую структуру спермы благодаря современным криопротекторам, которые позволяют избежать повреждения структур клетки низкими температурами.

   Методика криоконсервации состоит в специальной обработке и подготовке спермы криопротектором по специальной программе, затем подписанный контейнер помещается в жидкий азот и хранится при температуре минус 196 градусов по Цельсию.

   Хранение возможно длительное время. Наибольшая длительность хранения криоконсервированной спермы с положительным исходом беременности составила 13 лет.

   Многолетняя практика подтверждает, что процедура ЭКО с использованием замороженной спермы и/или эмбрионов увеличивает шансы на беременность и не влияет на здоровье будущего ребенка.

   Криоконсервация является некоторой "биологической поддержкой" для пары: нельзя точно предсказать, будет ли успешной попытка получения хорошего качества материала и оплодотворение при возможной следующей попытке. 

Криоконсервация эмбрионов

   Эффективность  трансплантации эмбрионов крупного  рогатого быдла во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методам консервации эмбрионов является их глубокой заморахивание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.

   Долговременное  хранение глубокозамороженных эмбрионов  моей шеренга перевесов. Отпадает необходимость во удержания больших стад или групп реципиентов, ведь пересадки могут быть проведенные в любое время независимо от терминов взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Помимо того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки от генетическо ценных животных, а тоже сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По пометке специалистов криоконсервация эмбрионов экономично оправданная, она исключает генетический дрейф, т.е. смена частоты генов в популяции, вызываемые случайными причинами.

   При сохранении  правильной биотехнологии выживаемость  эмбрионов складывает 90%, а стельность  коров-реципиентов после нехирургической  пересадки находиться в границах 50-55%. Однако нередко в производственных  условиях при несохранении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации. Обоснованное, что использование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, когда выживаемость эмбрионов после размораживания будет ни менее 80%, а процент стельности коров-реципиентов сложит 55-60%.

   По принятой  в России технологии, эмбрионы  замораживают с употреблением  автоматических инструментов, обеспечивающих  регулирование скорости охлаждения  в заданных режимах. Эмбрионы  замораживают в пробирках 50x6 мм  или в ампулах емкостью 1 мл. В  пробирку или ампулу вносят 1-4 эмбриона от одного донора  и 0.4 мл раствора криопротектора (1.5 М ДМСО или 10%-ной раствор глицерина). Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовой водки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 к -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и опускают в жидкий азот. Употребляется тоже и другой режим: охлаждение от -7 к -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 к -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и опускание в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов изготавливается на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10-12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара разных типов.

   Практика  криоконсервации эмбрионов крупного рогатого быдла свидетельствовать о тех, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает ни только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации стоит отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, помещенные на стадиях позже морулы или ранней бластоцисты.

   Необходимость  отбора эмбрионов диктуется еще  и тем обстоятельством, что  в 10% с их выявляется неправильное  развитие, а при криоконсервации повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чего переживаемость и следующее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются.

   Таким  образом, сохранение правильной  биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов разрешить обеспечить стельность реципиентов на тем же уровни, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в грядущего может быть существенно упрощенный, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без следующих манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут сохраняться десятки и сотни годов. 
 
 
 
 
 
 
 

Заключение

Таким образом, многолетний опыт развития биотехнологии  подразумевает метод криоконсервации как пока еще не опробованный в полной мере. И с начала развития данного метода по сей день ведутся многочисленные споры, касающиеся морально-этических вопросов. Стало привычным и даже обыденным появление проблем, направленных на чувство гуманности у общественных масс и ученых сообществ. Пройдет немало лет, прежде чем какой-нибудь вопрос не приведет обе противостоящие стороны к консенсусу. А до этого, метод криоконсервации так и останется наполовину запрещенным и довольно поверхностно изученным. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  используемых источников:

1. ncbt.nauka.kz

 
 

2. www.biotechnolog.ru

 
 

3. www.cbio.ru

 
 

4. www.biorosinfo.ru