Картирование генома

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, о локализации  и функциях отдельных генов и  о структуре генома в целом  вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в Университете Джона  Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора Мак-Кьюсика. Результатом  этих исследований является систематическое, с двухгодичным интервалом между  последними шестью публикациями, издание  энциклопедий под названием: "Менделевское наследование у человека: каталог  генов человека и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in men. Catalog of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes"). Эти издания содержат сводные данные обо всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях. Появление и развитие компьютерных баз данных, возможность совмещения различных типов карт позволило перейти на качественно новый уровень анализа картированных последовательностей.

1.2. Цитогенетическое картирование.

Одновременно, в эти же годы, были достигнуты большие успехи в области  цитогенетики, связанные с возможностью дифференциального окрашивания  метафазных хромосом. Методы дифференциального окрашивания позволяют идентифицировать на препарате как отдельную хромосому, так и любой участок хромосомы, выявляя так называемые бэнды. На метафазных хромосомах малой степени спирализации идентифицируются около 750 бэндов, на прометафазных хромосомах 2500 - 3000. На сегодняшний день разработаны методы многоцветной окраски - multicolor banding (до 25 цветов) интерфазных и метафазных хромосом.

Рис.3Цитогенетический анализ клона гибридных клеток, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши со спленоцитами, с помощью FISH с меченной биотином пробой специфической к Х -хромосоме. Видно, что в кариотипе гибридов присутствует только одна Х -хромосома. Результаты анализа с помощью ПЦР маркеров показали, что эта X-хромосома происходит из спленоцитов (линия мышей DD) (b). Эти результаты свидетельствуют о том, что в гибридных клетках произошло замещение собственной Х -хромосомы клеток НМ-1 (мыши 129/Ola) на Х -хромосому спленоцитов взрослой самки DD

Цитогенетические карты показывают локализацию маркера с точностью  до определенной хромосомы, плеча или  хромосомного сегмента. Этот тип карт показывает линейный порядок маркеров в хромосоме. По своей разрешающей способности они занимают промежуточное положение между генетическими картами и собственно физическими картами (ряд авторов относит цитогенетическое картирование к методам физического картирования геномов). Цитогенетические карты основываются на расположении генов без определения их вариабельности, тогда как возможность построения генетических карт зависит от наличия аллельного полиморфизма локусов. Построение цитогенетической карты облегчает развитие других типов физических карт, а именно, дает "скелет", на котором помещаются маркеры или контиги перекрывающихся клонов.

Для построения цитогенетических карт млекопитающих в настоящее время  используется ряд методов. Определение  хромосомной, а в большинстве  случаев и субхромосомной локализации  маркеров проводят с использованием гибридов соматических клеток между  различными видами млекопитающих или  непосредственной гибридизации in situ уникальных молекулярных зондов на митотические хромосомы. К основным методам формирования цитогенетических карт относятся также - хромосомный сортинг (проточная  цитометрия), микродиссекции и микроклонирование  определенных геномных фрагментов и  сравнительное генетическое картирование (сравнительная цитогенетика).

В 90-е годы метод гибридизации получил  развитие в модификациях: FISH (гибридизация с использованием флюоресцентной метки) и PRINS (метод, сочетающий гибридизацию на метафазных хромосомах специфических праймеров с последующей ПЦР, включающей меченый биотином нуклеотид в продукт амплификации). Этот подход стал основным методом для построения цитогенетических карт.

Разрешение этого метода составляет от 1 до 3 млн.п.н., поэтому гибридизация является методом картирования с низким уровнем разрешения.

Среди цитогенетических методов большое  распространение получил метод  картирования геномов млекопитающих  с помощью гибридов соматических клеток, с которым связан первый прорыв на пути построения карт генома человека и успехи клеточной биологии. В 70-ым годам была разработана техника экспериментального конструирования способных к размножению межвидовых клеточных гибридов. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния культивируемых соматических клеток разных видов, в частности клеток человека и различных грызунов: китайского хомячка, мыши, крысы. Гибридные клетки, значительно превосходящие по своим размерам исходные родительские клетки, оказываются способны не только переживать в условиях культивирования, но и размножаться. Однако размножение этих тетраплоидных гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом, причем в первую очередь элиминируются хромосомы человека.

Так были получены панели гибридных  клеточных клонов, содержащих всего  одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение белков человека, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет определить хромосомную принадлежность соответствующих генов. Техника соматической гибридизации явилась одним из наиболее мощных инструментов для нахождения связей между группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и даже их отдельными сегментами. Таким способом удалось локализовать сотни аутосомных генов.

Соматические гибриды спонтанного  происхождения были получены в 1960 году, с тех пор развитие работ по гибридам соматических клеток шло по следующим направлениям: 1) поиск  безопасных, удобных и эффективных  агентов для слияния клеток; 2) создание селективных систем, позволяющих  выделять гибриды соматических клеток; 3) изучение феномена сегрегации хромосом, направления и степени, а также  возможности направленной сегрегации в соматических гибридах; 4) использование  гибридов соматических клеток для создания хромосомных карт млекопитающих.

Для тонкого картирования разработаны  два метода: перенос генов, опосредованный хромосомой (CMGT) и перенос генов  в процессе слияния облученной клетки-донора с необлученным реципиентом (IFGT, от англ. irradiation and fusion gene transfer). Первый способ предполагает инкубацию очищенных  митотических хромосом с клетками реципиента в присутствии фосфата кальция. При этом происходит встраивание  фрагментов донорных хромосом в хромосомы  клетки-реципиента. Для идентификации  гибридов, содержащих нужные фрагменты ДНК донора, применяют соответствующие методы селекции.

Наиболее широко распространенный пример такого подхода - НАТ-селекция (от англ. hypoxanthine, aminopterin, thymidine) [69]. В присутствии  аминоптерина (или сходного с ним  метатрексата) ингибируется синтез новых  предшественников ДНК. Клетки, лишенные фермента тимидинкиназы (ТК), не могут  утилизировать экзогенный тимидин  и гибнут в присутствии аминоптерина. Аналогично, клетки, лишенные гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT), не могут усваивать гипоксантин  и также, нежизнеспособны в присутствии аминоптерина.

К сожалению, встроенные фрагменты  хромосом зачастую претерпевают реорганизацию, кроме того, есть достоверные данные о предпочтительном проникновении  в клетку последовательностей из центромерных областей. Эти недостатки не позволяют использовать CMGT для  тотального картирования, хотя данный метод весьма эффективен для обогащения специфическими фрагментами хромосом - составной части стратегии клонирования, называемой "обратной генетикой".

1.3. Физическое картирование.

В отличие от генетических карт, построенных  на основе групп сцепления и дающих статистические расстояния между ДНК-маркерами  и генами, физическое картирование позволяет определять физические расстояния между маркерами в каждой хромосоме.К методам физического картирования относят рестрикционное картирование, RH-картирование, клонирование в YAC (от англ. yeast artificial chromosome), BAC (от англ. bacterial artificial chromosome), космидах, плазмидах и других векторах и контиг-картирование на их основе, а также секвенирование ДНК.

Рис.4 Генетическая карта норки содержит 85 генов, 82 из которых картированы в лаборатории; для 18 генов установлена их региональная локализация, для 8 показан их порядок, а 7 генов были отнесены к группам сцепления хромосом 7 и 12. Рядом с идиограммами хромосом норки приведены данные по ZOO-FISH. Видно, что в геноме норки существуют крупные районы хромосом, гомeологичные хромосомным районам человека

Использование искусственных хромосом создает основу для проведения физического  картирования как на хромосомном, так и на субхромосомном уровне.

Основой физического картирования генома является построение физических карт, т.е. определение порядка расположения физических маркеров вдоль молекулы ДНК. В качестве физических маркеров могут выступать сами гены, анонимные  фрагменты ДНК (D-сегменты), точки  расщепления ДНК рестриктазами и т. п.

Однако при развитии работ по физическому картированию геномов  млекопитающих исследователи столкнулись  с трудностями при совмещении данных по картированию. Для преодоления  этой проблемы в 1989 г. было предложено стандартизовать все обозначения  меченных последовательностей ДНК  в геноме, включая все типы картированных  последовательностей, будь то просто картированный  сегмент ДНК с неизвестной  функцией (D-сегменты), последовательность с необычными сайтами рестрикции, проба, выявляющая полиморфизм, последовательность, гибридизующаяся с определенным "бэндом" при гибридизации или STS-маркеры (от англ. "sequenсed tagged site").

Основной особенностью STS-маркеров, а также и основным требованием  к ним, является их уникальность в  геноме. Эти маркеры облегчают  перевод различной информации по картированию на единый "язык" STS для анализа и хранения генетической и молекулярной информации, кроме  того, оптимизируется процесс насыщения  физической карты генома человека маркерами. Созданные на сегодняшний день электронные  молекулярно-генетические базы данных значительно облегчают поиск  информации по картированию и секвенированию последовательностей любого изучаемого вида, позволяют оценивать степень  гомологии и эволюционной связи  между геномами различных видов. В настоящее время одно из основных направлений в данной области - это  перевод всех STS-маркеров на основу ПЦР для более удобного использования. К исходному секвенированному участку  ДНК подбирается пара праймеров, как правило, с учетом того, чтобы  расстояние между ними не превышало 1 т.п.н. для удобства проведения ПЦР. Если участок и праймеры к нему не имеют аналогов в базе данных, содержащих секвенированные на данный момент последовательности ДНК, то праймеры синтезируют и с ними проводят ПЦР, где в качестве матрицы используют тотальную ДНК генома. Если полученный амплификат представляет собой единственный фрагмент на геном, то эта последовательность может считаться уникальной и  может быть использована как STS. Вся  информация, касающаяся каждого маркера, хранится в базах данных (NCBI, EMBL, DDBJ, GDB и др.). Она включает в себя сведения о нуклеотидной последовательности праймеров, условия реакции ПЦР, длину продукта амплификации и его  нуклеотидную последовательность. Одним  из результатов международной программы "Геном человека" явилось создание такого количества STS-маркеров, которое  позволило покрыть ими весь геном  человека через каждые 50 т.п.н. вдоль  каждой хромосомы (на сегодняшний день в базах данных зарегистрировано более 60000 STS-маркеров).

Совмещение карт возможно благодаря  локализации многих клонированных  генетических маркеров на физических картах с помощью гибридизации, то есть привязке к определенным хромосомным  сегментам. Эти локусы служат для  взаимосвязи генетических карт с  физическими и дают возможность  выяснения соотношения между  генетическими расстояниями в сантиморганах  и физическими расстояниями, выраженными  в тысячах пар нуклеотидов.

Рис.6 Результаты экспериментов по тестированию плюрипотентности внутривидовых гибридных клеток от слияния эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (линия HM-1 получена от мыши линии 129/Ola, справа) со спленоцитами взрослой самки мыши (линия DD слева). При введении гибридных клеток в полость бластоцисты (реципиентная линия C57BL/J, слева) получено 5 химерных мышей, одна из которых представлена на рисунке в центре. Пятна желтой окраски появились в результате размножения гибридных клеток и их участия в формировании волосяного покрова химеры. Результаты биохимического анализа (маркер Gpi-1, кодирующий глюкозо-6-фосфат изомеразу) химер показали, что гибридные клетки внесли вклад в формирование большинства органов и тканей

4) Генетическое картирование  генома крупного рогатого скота (КРС)

Отечественным ученым принадлежит  приоритет в картировании генов сельскохозяйственных животных: в 1926 г. А. С. Серебровский и Е. Т. Васина-Попова описали расположение генов в половой хромосоме курицы. Успешно проводившиеся А. С. Серебровским исследования по генетическому картированию были прерваны и до сих пор в нашей стране на материале сельскохозяйственных животных не возобновлены. В то же время за рубежом интерес к построению генетических карт лабораторных и домашних животных все более возрастает. Иллюстрацией сказанного может служить то, что на исследования генома собаки с целью построения генетической карты этого вида в США ассигновано на 5 лет 750тыс. долларов. Целью этого проекта является нанесение на генетическую карту до 400 маркеров, что позволит в частности, определить локализацию генов тех или иных наследственных болезней.

Естественно, что особое внимание уделяется картированию геномов  важнейших видов сельскохозяйственных животных. Созданный в 1990 г.  проект их генетическое картирование должен был получить в 1991 г. финансирование в размере 10 мил.  долларов в год. Первый объект планируемых исследований – крупный рогатый скот, в дальнейшем предполагается изучить геном овец, коз, свиней, лошадей, кур. В настоящем обзоре мы рассмотрим современное состояние исследований, посвященных построению генетических карт генома крупного рогатого скота (КРС) – биологического вида Bos taurus.

При картировании генов крупного рогатого скота исследуются три метода. Первый из них – популяционно-генеалогический  анализ. Именно с помощью этого метода был обнаружен первый случай сцепления генов у крупного рогатого скота (тесное сцепление генов казеинов молока). КРС относится к числу малоплодных и медленно размножающихся животных, поэтому стандартный генетический анализ в этой же ферме, в которой он используется для картирования геномов лабораторных животных, в данном случае невозможен. Применяемый подход заимствован из арсенала генетики человека и состоит и состоит в определении достоверности отклонения наблюдаемой частоты рекомбинации между двумя генами от 0,5 т. е. определяется наличие сцепления. Соответствующий статистический тест носит название lod-score-test. При использовании этого теста для каждой семьи, в которой обнаружено расщепление по анализируемым генам вычисляется величина z: