Генетический контроль апоптоза

Министерство  образования и науки, молодёжи и  спорта Украины

Харьковский национальный университет имени  В.Н. Каразина 
 
 
 

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ  КОНТРОЛЬ АПОПТОЗА 
 
 
 
 

Курсовая  работа

                                                                                   по курсу «Генетика развития» 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Харьков  2011г 
 

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1.Пути апоптоза в клетке

2.   Молекулярные механизмы регуляции апоптоза

2.1 Белок  р-53 — элемент системы контроля за апоптозом

2.2 Семейство  Всl-2-белков, регулирующих апоптоз

2.3Регуляция  экспрессии С095(Fas/АР0-1)-рецептора другими клеточными рецепторами

2.4 Регуляция  апоптоза цитокинами

3.Апоптоз у растений.

Вывод 

 

Введение  

Апопто́з— программируемая клеточная смерть, регулируемый процесс самоликвидации на клеточном уровне, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты  погибшей клетки обычно очень быстро (в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции. Морфологически регистрируемый процесс  апоптоза продолжается 1—3 часа. Одной  из основных функций апоптоза является уничтожение дефектных (повреждённых, мутантных, инфицированных) клеток. В  многоклеточных организмах апоптоз  к тому же задействован в процессах  дифференциации и морфогенеза, в  поддержании клеточного гомеостаза, в обеспечении важных аспектов развития и функционирования иммунной системы. Апоптоз наблюдается у всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и вплоть до высших организмов. В  программируемой смерти прокариот  участвуют функциональные аналоги  эукариотических белков апоптоза.Исследования программируемой клеточной смерти ведутся с конца 1960-х годов. Термин «апоптоз» был впервые употреблён в 1972 году в работе британских учёных — Дж. Керра, Э. Уайли и А. Керри. Одними из первых к изучению генетики и молекулярных механизмов апоптоза приступили С. Бреннер, Дж. Салстон и  Р. Хорвиц, все трое в 2002 году были удостоены  Нобелевской премии по физиологии или  медицине за открытия в области генетической регуляции развития органов и  за достижения в исследованиях программируемой  клеточной смерти. В настоящее  время установлены основные механизмы  реализации апоптоза в эукариотических  клетках, активно ведутся исследования регуляторов и активаторов апоптоза. Интерес учёных связан с возможностью применения знаний о программируемой  клеточной смерти в медицине при  лечении онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний.По предположительным оценкам порядка 1010—1011 клеток человеческого тела ежедневно  погибает путём апоптоза.[1] 
 

1. Пути  апоптоза в клетке

 

 Существуют  два основных пути апоптоза  в клетке:митохондриальный путь  и путь через рецепторы апоптоза.

1. Рецепторы  апоптоза - семейства белков CD95 (Apo-1 или Fas) и TNF-R (фактор опухолевого  некроза). TNF-альфа высоко цитотоксичная  молекула, использовалась как лекарство  против рака. TNF-R1 рецептор широко  распространен и поэтому не  может быть избирательным. Другие  представители этого семейства  (не все) имеют домен клеточной  смерти (DD) - домен белок-белкового  взаимодействия связывающийся с  белком адаптором, таким как  FADD. Активация рецепторов апоптозалигандами  (например, CD-95L и TNF-альфа приводит  к активации каспазы-8, запуская  каскад реакций ведущих к апоптозу.

2. Митохондриальный  путь. Митохондрии выполняют центральную  роль в апоптозе, при этом наблюдается  увеличение проницаемости митохондриальной  мембраны. Баланс между про- и  анти-апоптозных членов семейства  Bcl-2 регулирует выход про-апоптозных  веществ из митохондрий, ведущих  к запуску апоптоза, таких как  AIF, эндонуклеаза G, Smac/DIABLO и цитохром C. Утечка цитохрома-С из митохондрии  приводит к образованию апоптосомы  в цитоплазме, которая активирует  каспазу-9 и запускает клеточную  смерть.

 Оба  пути приводят к активации  каспаз и запуску каскада реакций  приводящих к гибели клетки.

Каспазы (caspase) - ферменты расщепляющие белки  по остаткам аспартата. Они содержат цистеиновые остатки на своих  активных центрах. Многие изоформыкаспаз ведут к апоптозу. Они могут  быть активированы двумя путями: через  рецепторы апоптоза и митохондрии.

 Первая  открытая каспаза - Ced-3 (Cell Death-3), обнаруженная  у нематоды C. elegans. Мутация Ced-3 предотвращала  гибель 131 клетки в процессе нормального  развития нематоды. Гомолог Ced-3 у  млекопитающих - интерлейкин-1альфа-преобразующий  фермент (ICE) и был позже назван  ингибитор каспазы-1.

Каскад  активации каспаз

Известно 14 каспаз, которые подразделяются на инициаторы, эффекторы и стимуляторы. Инициаторы (каспаза-8 и -9) расщепляют и  активируют каспазыэффекторы (каспаза-3). Эффекторы расщепляют различные белки, что ведет к гибели клетки. Активация каспаз ведет к запуску протеолитического каскада реакций ведущих к гибели клетки. При этом одни каспазы активируют другие - амплификация сигнала. Каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух больших (~20kDa) и двух малых субъединиц (~10kDa). Большая и малая субъединицы образуется в результате расщепления прокаспазы. Каспаза содержат два активных центра QACXG. Ингибирующий домен (DED или CARD) может быть вырезан из каспазы.Эффекторныекаспазы активируются другими каспазами (трансактивация). Инициаторныекаспазы активируются автоактивацией, которая происходит при взаимодействии нескольких прокаспаз (например, прокаспаза-8 и DISC). Рецептор апоптоза сам по себе не обладает протеазной активностью.

 Активация  каспазведет к различным последствиям: каспаза-9 разрушает ядерные поры, что ведет к проникновению в ядро каспаз-3 и -7. Каспаза-3 расщепляет ингибирующую субъединицу ICAD в двух местах. Выпуск CAD приводит к расщеплению ДНК между нуклеосомами.

Каспазы ведут к реорганизации цитоскелета  и распаду клетки на апаптозные тельца.

Каспазы - семейство цистеиновыхпротеиназ, главные эффекторы апоптоза, существуют в клетке как неактивные проформы и зимогены, которые расщепляются на активные формы ферментов, активируя  апоптоз.

Лиганд-->рецептор смерти-->активация инициаторов  каспаз (каспаза-8, -10)-->каскад активации  других каспаз>активация каспаз-3, -6-->инактивация клеточных структур.

Разрушение  клеточных структур при апоптозе:

 Фрагментация  хромосомной ДНК неактивный фермент  CAD в комплексе с ICAD (ингибитор  CAD-фактор фрагментации ДНК) расщепляется  каспазой-3 высвобождая CAD, кот разрезает  ДНК м-унуклеосомами

Инактивация ферментов вовлеченных в репарацию  ДНК - фермент поли (ADF-ribose) полимераза, или PARP- первый белок обнаруженный как  субстрат для каспаз. PARP вовлекается  в репарацию ДНК и катализирует синтез (ADF-ribose) и закрепляет на цепи ДНК ломая и изменяя ядерные  белки. Способность PARP репарировать разрушения ДНК предотвращается последующим  расщеплением PARP каспазой-3

Инактивация белков вовлеченных в репликацию. Каспазы могут инактивировать ДНК  топоизомеразу II, способствуя разрушению ДНК.

 Разрушение  структурных ядерных белков. Каспаза-6 разрушает ламины разрушая ядро, что приводит к конденсации  хромосом.

 Чувствительность  клеток к стимулам изменяется  в зависимости от экспрессии  про- и анти-апоптозных белков (Bcl-2 белок ингибитора), серьезности  стумулов и стадии клеточного  цикла. Распад клетки на везикулы, переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями.

 Инициаторы  апоптоза:

- внешние сигналы (связывание лигандаиндуцирующего смерть рецептором на клеточной пов-ти), быстрый вариант а

гранзим B может доставляться в клетки цитотоксичными T лимфоцитами, когда они узнают инфицированную клетку, активирует каспазы-3, 7, 8 и 10.

-клеточный стресс – радиация, химикалии, вирусная инфекции, недостаток фактора роста, ox стресс | кол-во bcl-2 белков определяет кол-во стресса необходимого для запуска а. Если митохондрии не справляются с удалением активных форм O2, последнии инициируют открытие пор во внеш. м-не и выход в цитозоль белка, ответственного за каскад реакций, ведущих к синтезу протеаз, нуклеаз

 Митохондрия  может быть ключевым регулятором  каспазного каскада и апоптоза - избавление от цитохрома С  в митохондрии может вести  к активации каспазы 9 и затем  каспазы 3. Этот эффект достигается  через образование апоптосомы  – мультипротеинового комплекса  включающего цитохром C, Apaf-1, прокаспазу 9 и АТФ[2] 
 
 
 

2. Молекулярные  механизмы регуляции  апоптоза

 
 

Накопившиеся  в литературе данные показывают, что  молекулярные механизмы, ответственные за апоптоз, консервативны среди организмов. Для примера: нематодный ген ced-9,который предохраняет от апоптоза в С. elegans, похож на человеческий протоонкогенBcl-2, который предохраняет от самоубийства многие клетки. В дополнение к этому, нематодный ген ced-3, который вызывает клеточную смерть у С. elegans, похож на человеческий ген IСЕ. Более того, нематодный ген ces-2,который вовлечен в регуляцию апоптоза в специфических нейронах, структурно похож на человеческий транскрипционный фактор HLF (hepaticleukemiafactor). Таким образом, механизмы апоптоза могут быть консервативны как среди простейших, так и среди сложных видов. Однако эволюция внесла некоторые новые механизмы передачи сигнала в предсуществующий каскад программированной клеточной смерти.

2.1 Белок р-53 — элемент системы контроля за апоптозом

Центральным компонентом системы контроля за апоптозом является белок р53. Именно на р53 сходятся многообразные сигналы, сообщающие о возникновении «нештатной» ситуации. При этом происходит быстрое увеличение экспрессии р53 и переход в функционально активное состояние.р-53 запускает ряд внутриклеточных процессов, ведущих к самоограничению или к самоубийству клетки. Дикий тип гена р53 (mtр-53) индуцирует апоптоз, а протоонкогеныВсl-2 и Всl-х его блокируют. В результате мутации гена дикого типа образуется мутантный тип гена р53 (mtp-53) и клетка теряет способность к естественной смерти (апоптозу), следствием чего является возникновение опухоли. Дикий тип гена р-53 является геном-супрессором, ингибирующим трансформацию клеток, мутантный ген р-53 является онкогеном, который, наряду с другими онкогенами, участвует в механизмах канцерогенеза. Дикий ген р-53 не только индуцирует апоптоз, но также блокирует клеточный цикл, возможно, совместно с с-myc-геном, на стадии G1 или перехода фазы G1 в S-фазу. Дикий тип человеческого гена р53 и температуро-чувствительные мутанты индуцируют экспрессию СD95(Fаs/АР0-1)-антигена. Когда клетки линий Н358, Н460 и К562 трансфецировалитемпературо-чувствительными мутантами, то экспрессия СD95(Fаs/АР0-1)-антигена повышалась в 4-6 раз. Таким образом, онкоген вызывает в клетках два эффекта: он останавливает клетки в G1/S фазе клеточного никла и является триггером апоптоза.

2.2 Семейство Всl-2-белков, регулирующих апоптоз

Всl-2. Первым обнаруженным белком, регулирующим апоптоз, был Всl-2, кодируемый протоонкогеномВсl-2.Транслокация гена приводила к развитию фолликулярнойлимфомы у человека. Затем было выявлено целое семейство Всl-2-генов, контролирующих апоптоз. На сегодняшний день уже клонировано девять гомологов Всl-2 у млекопитающих и два вирусных гомолога. Эволюционный анализ показал, что будут открыты еще новые гомологи Всl-2. В табл. 3.1 представлена топология белка Всl-2 и домены семейства Всl-2.

Таблица 2.1

Члены семейства протеинов Всl-2, или подобно Всl-2, угнетают апоптоз, или, подобно Вах, индуцируют апоптоз. В табл. 3.2 показано влияние белков семейства Всl-2 на апоптоз.

Ранние  работы показали, что Всl-2 функционирует как центральная репрессорная молекула апоптоза. ПротоонкогенВсl-2 впервые был описан как результат хромосомнойтранслокацииt(14; 18) в 85 % В-клеточных фолликулярных лимфом человека. Эта транслокация переносит Всl-2 из его нормальной позиции в 18q21 в локус Н-цепи lg в 14q32. Это приводит к транскрипционнойдисрегуляции гена Вcl-2 и гиперэкспрессии белка Вcl-2 в лимфомных клетках. Белок, кодируемый Всl-2, является интегральным мембранным протеином с молекулярной массой 25 кДа, который локализован в митохондриальной

Таблица 2.2

мембране, околоядерной мембране и гладком эндоплазматическом ретикулюме. Этот белок защищает клетки от программированной клеточной смерти в некоторых экспериментальных системах и имеет онкогенный эффект, так как снижает апоптоз. Всl-2 рассматривается как важный регулятор процесса апоптоза.

В настоящее  время активно изучается механизм действия Всl-2. Была выявлена многогранность функции белка Всl-2. Интенсивные исследования биохимического базиса действия протоонкогенаВсl-2 показали, что он обладает двойным действием: может функционировать как ионовый канал, а также как адапторный белок.

Белки семейства Всl-2 не имеют гомологичных аминокислотных последовательностей с другими белками. Однако, трехмерная структура Всl-хL похожа на трехмерную структуру порообразующих доменов некоторых бактериальных токсинов, которыедействуют как каналы для ионов или белков. Близкими по структуре к Всl-хL являются дифтерийный токсин, который транспортирует фрагменты токсина через клеточную мембрану, и бактериальные порообразующие колли-цины, которые убивают Е. соli путем образования неселективных ионовых каналов. Исходя из этой близости, предположили, что семейство белков Всl-2 может функционировать как каналы для ионов и белков. Действительно, за последние годы накопились веские доказательства, полученные из экспериментов на трансфецированных клетках, а также на синтетических липидных мембранах,