Енергетичний баланс окиснення глюкози

   Вперше вона була описана Крістіаном Ґоттфірдом Еренбергом в 1835 році і названа Vibrio subtilis. В 1872 році була перейменована Фердінандом Коном на Bacillus subtilis.

   Клітини B. subtilis (рис. 2.1) видовжені, вузькі (3–5x0,6 мікрон). Під час фарбування за Грамом спостерігається забарвлення клітин в фіолетовий колір. При вирощуванні B. subtilis на агаризованих середовищах спостерігається утворення колоній таких типів (рис. 2.2) : плоскі, широкі, блискучі; плоскі, тусклі, злегка маслянисті; зморщені з піднятою складчастістю. У B. subtilis нараховується від 5 до 10 типів колоній на різних агаризованих середовищах. На рідких поживних середовищах B. subtilis утворює пластівцевоподібний, комковатий осад, іноді росте у вигляді плівки. Росте на МПА, МПБ, а також на середовищах, що містять рослинні залишки, на простих синтетичних живильних середовищах для гетеротрофів.                              

                      

   Рис. 2.1. Мікрофотографія                        Рис. 2.2. Колонії B. subtilis

   B. subtilis

   Однією  із постійних ознак у B. subtilis є утворення ендоспор при вирощуванні їх в аеробних умовах. Спороутворення розглядається як важкий процес диференціювання. Розвиток спор починається, коли популяція вегетативних клітин переходить в стаціонарну фазу. В період, перед споруляцією, в клітині знаходяться 2 нуклеотиди (0-стадія), які з’єднуючись, утворюють паличковидну структуру (1 стадія). Відбувається поява поперечної перегородки (септи) біля одного з полюсів клітини (2 стадія). В результаті формування септи від вегетативної клітини відділяється частина клітини, яка перетворюється в спору.

   Менша клітина містить цитоплазму, ДНК, мембрану. Поступово мембрана великої клітини обвиває малу і, таким чином мала перетворившись в проспору, стає як би поглинутою материнською клітиною (3 стадія). Проспора представляє собою протопласт, оточений двома шарами мембран. Далі відбувається формування нових поверхневих структур: між внутрішньою і зовнішньою мембранами закладається кортекс (4 стадія). На поверхні зовнішньої мембрани утворюється більш електроннощільний шар – оболонка спори (5 стадія). 6 стадія – формування спори. Відбувається синтез дипіколінової кислоти. 7 стадія – лізис клітини і вивільнення спори. Весь процес споруляції триває 8 годин.

   У B. subtilis  наявна капсула полісахаридної природи. Вважають, що біополімери капсули синтезуються назовні поверхні цитоплазматичної мембрани і виділяються на поверхню клітинної стінки в певних специфічних її ділянках. Також B. subtilis виділяє слизові речовини полісахаридної природи. Характерна наявність перитрихіально розміщених джгутиків.

   Досить  добре вивчені шляхи засвоєння  вуглеводів бактеріями роду Bacillus. У бацил наявний гліколітичний шлях розщеплення вуглеводів (дисиміляція глюкози) незалежно від наявності в середовищі кисню. В аеробних умовах клітини B. subtilis використовують від 60 % до 70 % глюкози за шляхом Ембдена – Мейергофа, іншу частину гексозомонофосфатним шляхом. При температурі інкубації 37˚С клітини B. subtilis при поглинанні 1 моля глюкози утворює 4 моля АТФ, а при підвищенні температури і концентрації глюкози тільки 2 моля АТФ на моль глюкози, яка споживається. B. subtilis характеризується респіраторним енергетичним метаболізмом, проте в анаеробних умовах ця культура зброджує глюкозу з утворенням 2,3-бутандіола, оцтової кислоти, етанолу, гліцерину, СО₂  [10].

   Більшість аеробних спороутвоювальних бактерій – мезофіли. Оптимум їх розвитку знаходиться в межах 30 – 40˚С. Із гарячих джерел Камчатки з температурою води 50 – 93˚С і рH 6,3 – 7,3 виділені спороутворювальні бактерії з температурним оптимумом розвитку біля 65˚С. Це В. subtilis. Можливо, що багато термофільних бактерій представляють собою варіанти мезофільних видів. Термофільні бактерії відрізняються підвищенною біохімічною активністю. Їх ферменти більш стійкі до нагрівання і денатуруючих сполук, ніж ферменти мезофілів. Серед бацил знайдені психрофільні форми, які мають здатність розмножуватись і утворювати спори при низьких температурах. Так, B. subtilis розмножуються при температурі 7˚С і нижче. Мінімальна температура розвитку психрофілів 5˚С. Але їх здатність існувати при високих температурах обмежена [7].

   Оптимум рH для розвитку B. subtilis – 7 (крайнє значення рH 8 і 2), тобто це нейтрофіли. Сінна паличка переносить концентрацію солей в середовищі від 2 до 25 %.

   Розмножується B. subtilis шляхом поділу клітини, які відбуваються після розподілу нуклеотидів. Варто відмітити, що у B. subtilis не спостерігалося повного розділення клітин навіть при повному завершенні процесу поділу.

   B. subtilis являється хемоорганогетеротрофом. В якості субстратів окислення використовують прості вуглеводи (моно- і дисахариди), деякі полісахариди (декстрин, крохмаль), органічні кислоти і спирти, а також складні високомолекулярні вуглеводи, частково пектин. Оптимальні умови вирощування – температура 30˚С, рH 6,5 – 7,0. Також встановлено,що бактерія здатна окислювати такі вуглеводні, як парафін та гексадекан [10]. Також відомо, що сінна паличка не потребує додаткових факторів росту, тобто вона є прототрофом.

   Тип цитохромної системи залежить від  умов живлення і стадії культивування. В мембранах вегетативних клітин сінної палички виявлені цитохроми типу а, с, b, аа3. Вміст цитохромоксидази значно вищий в вегетативних клітинах, ніж в клітинах, які знаходяться в стані споруляції. На середовищі з глюкозою цитохромів аа3 більше, ніж на середовищі з гідролізатом казеїна. Наявність у спорових бактерій різних механізмів переносу електронів обумовлює відмінність їх фізіологічних ознак при культивуванні в різних умовах [10].

   Клітинна  стінка жорстка. Вона складається з  пептидоглікану, полімеру цукрі та амінокислот. Пептидоглікан бактерій – муреїн. Інші складові клітинної стінки – тейхоєві, ліпотейхоєві кислоти, білки.

   Тейхоєві  кислоти являють собою гетерополімери гліцерофосфата  чи рибітфосфата, цукру. Тейхоєві кислоти Bacillus subtilis в експоненційній фазі росту містять біля 30 % всього запасу фосфору клітини. Також в цитоплазмі клітин сінної палички наявні включення. В якості запасних поживних речовин міститься глікоген, ліпіди, волютин.

   Згідно  з ІХ виданням Керівництва Бергі  з систематики бактерій (фенотипові систематика) Bacillus subtilis відносять до

   царство – Аrchaea 

   відділ  – Firmicutes

   клас  – Bacill

   ряд – Bacillalus

   порядок – Bacillales

   родина  – Bacillaceae

   рід – Bacillus

   вид – Bacillus subtilis [6]

   В останньому виданні Визначника Бергі описано 22 види роду Bacillus, які становлять 1-шу групу. Види роду Bacillus розділені в три морфологічні групи. Bacillus subtilis відноситься до першої групи, клітини якого не роздуваються при спороутворенні; спори еліпсоподібні чи циліндричні, розміщені центрально чи термінально. Види першої морфологічної групи підрозділяються на дві підгрупи: підгрупа А і підгрупа Б. Bacillus subtilis відносять до підгрупи Б. Культура характеризується відсутністю глобул в протоплазмі клітин.

     В таксономічних дослідженнях  роду Bacillus на теперішній час застосовуються методи генетичного аналізу. В клітинах аеробних спорових бактерій молярний вміст ГЦ-основ становить 32 – 65 % загальної кількості основ ДНК. За молярним вмістом ГЦ-основ в молекулі ДНК були вивчені наступні групи: 1 група; 2 група; 3 група.  Bacillus subtilis відноситься до першої групи (41,5 – 47,7 %) [10].

   Положення згідно книги «Prokaryotes» (1999 – 2001 рр., філогенетична  класифікація) рід Bacillus відносять до грампозитивних бактерій, які утворюють одну групу, яка складається з двох підгруп. Рід Bacillus входить до першої підгрупи «Clostridium»  (з низьким вмістом ГЦ у ДНК) [9]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

РОЗРАХУНКОВО  – ГРАФІЧНА ЧАСТИНА

   Розділ 3. Визначення показників росту при періодичному культивуванні                                                                                                                                                                                                                              мікроорганізмів

Завдання  3.1. Визначити:

- швидкість росту ( ) між 8 та 24 год культивування;

- рівень біомаси

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація ацетату натрію в середовищі 20 г/л;

 - тривалість лаг-фази.

   

   Рис. 3.1. Крива росту бактеріальної популяції

   Швидкість експоненційного  росту – це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Виходячи з величин початкової і кінцевої біомаси Х_о та Х_t у момент часу t₀ та t :

    ,

   Де  lg e =0,43429

   Швидкість експоненційного росту (питома швидкість  росту) може також бути розрахована  за формулою:

    .

   За  умовою t = 24 год, t₀ = 8 год. За графіком (рис. 3.1) визначимо концентрацію біомаси у даний момент часу t та t₀ : X_t =3 г/л, X₀ =0,78 г/л.

   Отже,

    год ^-1.

   Рівень  біомаси (концентрація біомаси) – це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

   Х= Х _макс. – Х₀.

   Згідно  з графіком (рис.3) вихідний рівень біомаси становить 0,22 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту – 7 г/л. Отже, концентрація біомаси становить

   7-0,22=6,78 г/л.

   Економічний коефіцієнт (Y) – відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату,

    .

   Економічний коефіцієнт може бути розрахований також  як відношення біомаси до заданого субстрату.

   Згідно  з умовою, початкова концентрація ацетату натрію 20 г/л, рівень біомаси становить 6,78 г/л, звідси економічний коефіцієнт

    , тобто 34%.

   Тривалість  лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом t_r, в який культура досягла певної біомаси Х_r , і моментом t_t, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби відразу ж після інокуляції починався експоненційний ріст.

   Тривалість  лаг-фази визначають за формулою

    , де

    .

   

   Рис. 3.2. Теоретична і реальна криві росту бактеріальної популяції

   За  умовою Х₀=0,22г/л; приймаємо Х_r таким, що дорівнює 2г/л. На реальній і теоретичній кривих(рис. 3.2) визначають час t_r та t_t потрібний для досягнення 2г/л біомаси: t_r =17,1год, а t_t=9,7 год. Швидкість росту розраховують за формулою для реальної кривої в інтервалі часу t_r =17,1год, та t_t=9,7 год. За реальною кривою визначають

   Х_r=2 г/л, Х_t=0,8 г/л. Отже, швидкість росту:

    год^-1.

   Знаючи  швидкість росту, можна визначити  тривалість лаг-фази:

    год.

   Отже, тривалість лаг-фази становить 9,52 год. 
 
 
 
 
 

   Завдання  3.2. Визначити константу швидкості поділу (ν) та тривалість генерації (g), якщо:

     початкова концентрація клітин  становить 10⁴ , а через 10 год – 10⁹ .

   Бактерії  розмножуються бінарним поділом, їх кількість збільшується в геометричній прогресії : 2⁰ ® 2¹ ® 2² ® 2³®….. 2ⁿ. Якщо на одиницю об’єму періодичної культури, що росте, припадає N₀ клітин, то після n поділів кількість клітин стане N₀ · 2n. Логарифмуючи, отримаємо: