Биотехнологии в селекции

Обнаружены азотфиксирующие микроорганизмы из семейств Spirillaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae и ряда других, способные сосуществовать с корневой системой злаков (рис, кукуруза, пшеница, сорго), снабжающей их углеводами. Наиболее широко работы ведутся с бактериями Azospirillum (Postgate, 1989). В серии опытов, проведенных в различных штатах Индии, инокуляция семян пшеницы, риса, сорго, проса ри-зосферными азотфиксаторами обеспечивала прибавки урожая зерна до 30% (Subba Rao, 1982).

Методы генной инженерии

К методам прямого переноса чужеродной ДНК в протопласты растений и  животных относится электропарация: кратковременные электрические разряды (1—100 мкс при напряженности поля 1000—10000 В/см2) увеличивают проницаемость мембран протопластов, куда и проникает находящееся в растворе ДНК. Так были получены трансформанты кукурузы, риса и сахарного тростника. В MCXA разрабатывается метод введения чужеродной ДНК с использованием электрофореза в агаровом геле. Показана возможность применения данного метода для трансформации каллусов пшеницы с последующей регенерацией из них трансгенных растений.

     Оригинальный способ  введения чужеродной ДНК в  злаки разработан в Корнельском  университете США. С помощью  генетического пистолета в клетки  растений выстреливают крохотные  вольфрамовые шарики, покрытые генетическим  материалом. Например, способ баллистической  трансформации применили для  введения гена вируса табачной  мозаики в клетки лука. Была  установлена экспрессия гена  в клетках (Уайк, 1988). Метод высокоскоростной баллистической трансформации в настоящее время широко используется в Центре "Биоинженерия", ИМГ, ИФР. ВНИИСБ при создании трансгенных растений пшеницы, кукурузы, подсолнечника, плодовых.

Нерешенные проблемы генной инженерии.

        Одной из самых значительных  трудностей генной инженерии  является введение в геном  больших генов или нескольких  функциональных генов. Это связано  с емкостью векторов для трансформации.  Гены, в особенности эукариотические значительны по размеру(5-15 т.н.п.), но они все чаще используются для трансформации растений. Но кроме выбранного гена векторные конструкции должны содержать в себе селективные гены. В некоторых случаях для укорачивания конструкции используют кДНК последовательности. Однако кДНК комплексы не всегда приемлемы из- за специфики сплайсинга in vivo.

Лимитирующим  фактором для трансформации растений может быть и то, что необходимый  признак кодируется несколькими  генами, и получение трансгенных растений обладающих такими признаками пока технически не выполнимо.

Отдельно  стоит проблема, возникающая при  экспрессии чужеродного гена. Часто  после двух  - пяти поколений активно  транскрибирующийся ген, перестает  экспрессироваться. Чаще всего инактивация трансгена происходит из-за метилирования регуляторных последовательностей, либо возможна репрессия в результате взаимодействия с промотором каких-то белков. Активировать такой выключенный трансген не представляется возможным. Спрогнозировать данную ситуацию довольно-таки трудно, так как она зависит от ряда факторов, в том числе и от последовательности самого белка и конкретном месте интеграции его в геном растения. Преодолеть это вероятно в какой-то мере возможно путем получения многократной трансформации и получения различных линий, несущих одинаковую векторную конструкцию с различными местами интеграции в геном растения.

Одной из самых  главных причин сдерживающих интенсивность  и эффективность работ по трансгенезу остается крайне слабое развитие исследований по идентификации эффективных генов, созданию банков генов и ограниченная научная база генетической инженерии, что связано с крайне слабой финансовой поддержкой в нашей стране генной инженерии, как важнейшего приоритета XXI  века.

Клеточная селекция

Более широкое  практическое применение в настоящее  время получило другое важнейшее  направление современной биотехнологии  — клеточная селекция как метод  создания новых форм растений путем  выделения мутантных клеток и  сомаклональных вариаций в селективных условиях.

Сомаклональные вариации (варианты) (somaclonal variations 
(variants)) [греч. soma — тело и clon — отпрыск, ветвь; лат. variatio — изменение; франц. variante, от лат. 
varians (variantis) — изменяющийся] — фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органельных геномов клеток; от истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и множественностью происходящих изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).

  Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro (в пробирке, вне живого организма), что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны — создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных. Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в отсутствии сезонности в работе, возможности использования миллионов клеток при отборе, направленности селекции путем применения селективных сред и выполнении работ в лабораторных условиях.

С развитием  культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера, который является разновидностью гиногенеза Keller et al., 1987).

В Селекционно-генетическом институте (г. Одесса, бывш. ВСГИ) методом гаплопродюсера были созданы первые два отечественные сорта ячменя Исток и Одесский 115. Сорт Одесский отличался повышенной продуктивностью и устойчивостью к болезням и был признан перспективным в ряде областей (Новолоцкий, 1986). В последующем этим методом были получены засухоустойчивые сорта Прерия и Степной дар (Новолоцкий, 1997). Срок выведения сортов ячменя при использовании гаплоидной селекции сокращается на 4—6 лет.

При изучении растений, регенерированных из соматических клеток в культуре in vitro, было установлено, что они генетически не всегда однородны. Эту, так называемую, сомаклональную изменчивость, как источник полезных мутаций стали использовать в селекции растений. У регенерантов в отличие от индуцированных мутантов редко наблюдается мозаичность, что является результатом их происхождения из единичной клетки, и поэтому сомаклоны могут быть стабилизированы в течение одного поколения.