Белки теплового шока

Доклад на тему «Тепловой  шок»

Выполнили: Магнушевская Е.К., Умудова Э.И.

1 – слайд. Название.

2 – слайд. План

3 – слайд. Введение.

Все живые клетки отвечают на повышение температуры  и некоторые другие стрессовые воздействия  синтезом специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ). У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.), проявляющаяся в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков. Такие белки получили название белков теплового шока, а само явление - синдром теплового шока.

Белки теплового шока (англ. HSP, Heat shock proteins) — это класс функционально сходных белков, экспрессия которых усиливается при повышении температуры или при других стрессирующих клетку условиях.

Повышение экспрессии генов, кодирующих белки теплового  шока, регулируется на этапе транскрипции. Чрезвычайное усиление экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока является частью клеточного ответа на тепловой шок и вызывается в основном фактором теплового шока (HSF англ. heat shock factor). Белки теплового шока обнаружены в клетках практически всех живых организмов, от бактерий до человека.

4 – слайд. Введение.

Этот  феномен  свойственен  всем организмам,  и его молекулярный  механизм  практически идентичен у бактерий,  архей и эукариот. При повышении температуры клетка начинает  синтезировать белки теплового шока,  к которым прежде  всего относятся молекулярные  шапероны (DnaK, GroEL)  и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP).  Эти белки выполняют две основные  функции - обеспечивают  фолдинг (сворачивание  в нативную  конформацию)  и деградацию поврежденных  белков.  Несмотря  на  полную противоположность этих  двух  функций результат их осуществления один – ликвидация поврежденных (и  потенциально  опасных  для клетки)  белков. Цитоплазматические  протеазы по  своей  структуре  напоминают  шапероны - древние машины для фолдинга. И те, и другие распознают  экспонированные  гидрофобные участки  неправильно  свернутых  или денатурированных белков. 

5 – слайд. История  открытия БТШ.

Открытие БТШ началось с работ Ф. Ритоззы в 1962 году на политенных хромосомах слюнных желез  личинок дрозофилы. Политенными  называются гигантские хромосомы, образованные стопками параллельно упакованных гомологичных нитей хроматина, которых может быть больше 1000. Это позволяет изучать политенные хромосомы под световым микроскопом, различать в них отдельные "диски", соответствующие генам, и наблюдать, как при активации генов плотная структура диска переходит в "пуф" - вздутие, образующееся за счет разрыхления структуры хроматина в активном гене и накопления синтезирующихся молекул РНК. Ф. Ритозза обнаружил, что повышение температуры с 20 до 37С приводит к образованию пуфов там, где они не появлялись при нормальной температуре. Так были открыты гены теплового шока. Правда, позднее было обнаружено, что их можно активировать рядом воздействий и при нормальной температуре. Кодируемые этими генами белки были идентифицированы только в 1974 году. Они получили название БТШ. Вскоре выяснилось, что синтез БТШ в ответ на увеличение температуры характерен для клеток всех типов живых организмов: бактерий, грибов, животных всех уровней организации, человека, низших и высших растений.

БТШ у всех организмов представлены большим набором полипептидов, и их принято именовать в соответствии с молекулярной массой, выраженной в килодальтонах (кД). Например, БТШ  с молекулярной массой 70 кД называют БТШ70. О существенной роли БТШ в  жизни клеток говорит их высокая консервативность в эволюции. Например, БТШ70 имеет высокое сходство аминокислотной последовательности у насекомых, птиц, млекопитающих, грибов и растений. Отдельные участки в БТШ70 сохраняют свыше 90% гомологии у бактерий и человека.

6 – слайд. Классификация  БТШ.

Согласно современной классификации, в основу которой положены различия в молекулярных массах, выделяют пять основных классов Hsp: Hsp100,90,70,60 и малые Hsp. Каждый из этих классов белков выполняют характерные функции. Так, белки семейства Hsp70(как и их бактериальный аналог DnaK), взаимодействуют с вновь синтезируемой на рибосомах полипептидной цепью, предотвращая преждевременное неправильное сворачивание незрелой полипептидной цепи и участвуют транспорте белка к определённым органеллам. Белки класса Hsp100 являются близкими родственниками белков теплового шока с молекулярной массой 70кДа и выполняют защитную функцию, предохраняя организм в условиях стресса. Hsp90 образует сложный комплекс с несколькими вспомогательными белками. Такой комплекс взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов, обеспечивает эффективное связывание гормона с рецепторами и последующий перенос гормон – рецепторного комплекса в ядро. Помимо этого, белки класса Hsp70 участвуют в направленном переносе нескольких типов протеинкиназ к участкам их функционирования. Белки семейства Hsp60 могут учавствовать в фолдинге сложно устроенных многодоменных белков, а также в АТФ – зависимом исправлении ошибок в структуре частично денатурированных белков.

7 – слайд. Молекулярные шапероны

Эти  белки  обеспечивают  правильный фолдинг синтезируемых  белков за счет энергии гидролиза  АТФ.  Они  особенно  важны  у  прокариот,  где  фолдинг  обычно  не  является котрансляционным.  Шапероны  могут  также вернуть  в  нормальную  конформацию  многие денатурированные  белки (накапливающиеся при многих стрессах, включая тепловой шок), а также предотвращают агрегацию олигомеров и обеспечивают  их  разделение.  Наконец, шапероны участвуют в секреции, поддерживая секретируемые белки в развернутом состоянии. Шапероны  из  семейств Hsp70  и Hsp60 присутствуют  в  цитоплазме  в наибольших  количествах.  Гомологом Hsp60  у E. coli  является GroEL,  формирующий гигантский  комплекс  с GroES,  в  центральной полости  которого  целиком может поместиться белок размером до 55 кДа. GroES-GroEL  комплекс  имеет существенное сходство с эукариотической 26S протеосомой,  ответственной  за  деградацию меченых убихитином белков.  У E. coli гомологом Hsp70 является DnaK, который  образует  комплекс  с  кошапероном DnaJ и белком GrpE. E. coli  также имеет дополнительные шапероны ,  такие как SecB, ClpB  и IbpAB, взаимодействующие с белками,  являющимися плохими субстратами для шаперонов Hsp70  и Hsp60 семейств.

8 – слайд. АТФ  – зависимые протеазы.

В  отличие  от  эукариот,  где множественные  системы  мечения  белков убихитином  направляют  различные  субстраты  к  единственной  цитоплазматической  протеазе (26S  протеазе),  за  распознавание  субстрата  у прокариот отвечают сами протеазы, поэтому их в  клетке,  как  правило,  несколько (порядка шести).  Энергозависимые  протеазы представляют  собой,  как  правило, крупные олигомерные  комплексы.  Для  всех  протеаз этого  класса  с  известной  структурой протеазные  сайты  располагаются  во внутренней камере олигомера, вход в которую слишком мал для большинства нативных (свернутых)  белков.  Поступление субстрата внутрь  такой полости обеспечивается регульторными АТФазными доменами (или субъединицами).  Не  удивительно,  что именно АТФазные  субъединицы  отвечают  за субстратную  специфичность.  Аминокислотные последовательности  АТФазных  субъединиц  разных протеаз  имеют  сходство,  которое  может  свидетельствовать  о  сходстве  механизмов  их  действия. Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов приводящие  к  их  деградации,  не  зависят  от  свойств,  необходимых  для  разрезания  пептидных  связей. Как  только  белок  распознается  и  связывается  регуляторным  АТФазным  доменом,  начинается последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 аминокислот

9 – слайд. АТФ  – зависимые протеазы.

ClpAP ClpXP

У  этих  протеаз  АТФазная  и  протеазная активность  принадлежат  разным субъединицам,  и  неудивительно,  что  эти субъединицы  способны  действовать самостоятельно. ClpA  и ClpX  могут действовать  как  шапероны.  Гены clpX  и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в  моноцистронном  опероне.  Оба  оперона имеют типичные промоторы теплового шока.

HflB(FtsH)

Zn  и  АТФ-зависимая   протеаза, участвующая  в  деградации  цитоплазматических  и  мембранных  белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата  секреции). Единственная АТФ-зависимая  протеаза, существенная для жизни  E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором.

Lon

Деградирует  белок N  фага  λ,  ингибитор клеточного  деления SulA,  позитивный регулятор  биосинтеза  капсулы RcsA  и  др. Кроме  специфических  мишеней, Lon деградирует  большинство  аномальных  белков E. coli.  Белок –  гомотетрамер,  имеет  сайты связывания  с АТФ и ДНК, причем  связывание с  ДНК  стимулирует  протеазную  активность. Транскрибируется  с  промотора  теплового шока.  В  белке  можно  выделить  два  домена – собственно  протеазный  с  карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте и  следующий  за  ним  АТФазный. Экспериментально  показано,  что  эти  два домена  могут  быть  экспрессированы  как отдельные  полипептиды,  смесь  которых функционально  соответствует  интактной протеазе Lon.

10 – слайд. Регуляция теплового шока у B. subtilis

Гены  первого класса (регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных шаперонов DnaKJ-GrpE и GroEL-GroES,  и их  экспрессия  негативно контролируется  репрессором HrcA,  первым  геном оперона DnaK. Действие  этого репрессора  осуществляется  через связывание  с оператором – инвертированным повтором CIRCE. Контроль  этого регулона  осуществляется при участии шаперонов GroEL-GroES.  Этот  шаперон необходим для фолдинга HrcA,  а титрование шаперона образующимися в стрессовых условиях аномальными белками приводит к снижению активности HrcA - 24 и усилению экспрессии оперонов GroE и DnaK. Таким образом, у грамположительных бактерий GroE, а не DnaK играет основную роль в регуляции теплового шока. Репрессор HrcA  и CIRCE-элементы  быки  обнаружены  не  только  у  грамположительных,  но  и  у альфа-протеобактерий,  цианобактерий,  хламидий  и  спирохет,  однако  их  роль  в  регуляции теплового шока варьирует. 

Кo второму классу относится большая группа (50-100) генов, позитивно контролируемых сигма-фактором  общего  стресса σB,  которые  кроме  тепла  индуцируются  еще  и  голоданием  по  глюкозе  или кислороду.   Этот  сигма-фактор  регулируется  сложным  каскадом  белок-белковых  взаимодействий (включая фосфорилирование). 

К третьему классу относятся все остальные гены, не имеющие общей системы регуляции.

11 – слайд. Hsp70.

Одними из первых шаперонов стал БТШ Hsp70. Белки этого семейства объединяют одинаковая молекулярная масса и гомология N – концевого фрагмента. Последняя достигает 50% у бактериального DnaK и Hsp70 человека. В одной клетке высших можно одновременно встретить несколько компонентов семейства Hsp70: индуцибельный Hsp70, миохондриальный Mtp70 и резидент эндоплазмотического ретикулума Grp78.

Члены семейства  белков теплового шока Hsp70 можно считать одними из самых первых открытых шаперонов, и к настоящему времени достаточно хорошо изучен шаперонный механизм, основанный на этих белках. С помощью этого механизма он выполняет двойственную роль: исправляет структуру вновь синтезированных или повреждённых полипептидов или способствует деградации «неисправимых» белков в протеасомах.

Функции: защитная и  иммуномодулирующая.

12 – слайд. Hsp70.

Анализ последовательности гена и позднее структуры самого белка Hsp70 с помощью метода малоуголового рентгеновского рассеяния показал, что молекула Hsp70 молекула Hsp70 состоит из двух доменов – АТФ- и пептидсвязывающего, занимающего соответственно N – C – концевые фрагменты молекулы.

В состав семейства Hsp70 входят белки – помощники такие как:

1. Белки содержащие J – домен: Hdj1/Hsp40, Hdj2 (узнаёт и связывает белок с измененной структурой и передаёт последней Hsp70)
2. Нуклеотид – обменщик Bag–1 и Hip
3. Фактор связывания шаперонов Hsp70 и Hsp90 Hop

(Шаперонный аппарат  работает след. Образом. Кошаперон Hdj1 или Hdj2 узнаёт и связывает белок с изменой структурой и передаёт последний Hsp70. Шаперон в момент связывания находится с АТФ форме, т.е. в промежуточном состоянии, в котором он может отпустить субстрат или может вступить с ним в достаточно жёсткий комплекс. В первом случае шаперон не находит никаких изъянов в молекуле субстратного полипептида, а во втором такие изъяны, точнее экспонированные гидрофобные участки, имеются. Процесс захвата субстрата контролируется каким – либо из белков, содержащих J – домен, например Hdj1, который, связывается с АТФазным доменом и С – концевой последовательностью аминокислот EEVD, изменяет конформацию Hsp70; при этом происходят инициация АТФазы шаперона и гидролиз АТФ и комплекс субстрата с Hsp70 в FLA – связанной форме становятся устойчивым. Для высвобождения полипептид отходит, а Hsp70 переходит в промежуточное состояние. Дальнейшая судьба освобождённого полипептида зависит от того, насколько его структура выправилась, и в этом плане имеется несколько сценариев. Во – первых, белок, обретший правильную с точки зрения клетки форму, может транспортироваться в органеллы, где он должен функционировать. Во – вторых, в случае недостаточной эффективности исправления структуры белка он подвергается повторному шаперонированию в основных системах на Hsp70 – Hsp9)

4. CHIP. ( В середине 1990-х годов появились данные о том, что Hsp70 участвует в направленной деградации белков в 26S – протеасомах. Деградация белков в этих частицах достаточна специфична, и субстратами служат меченные убиквитином белки. Было установлено, что кошаперон Bag – 1 участвует в доставке белковых субстратов в протеасомы и что в этот процесс вовлечён ещё один белок CHIP. В молекуле CHIP имеется мотив TRP, который необходим для взаимодействия белка с С – терминальными областями молекул шаперонов hsp70 и Hsp90 Избыточная экспрессия CHIP приводит к подавлению шаперонной активности Hsp70 специфически на этапе её инициации белком Hdj1 )

13 – слайд. Hsp70.

Основной шаперон Hsp70 с помощью кошаперонов Hdj1 и Bag – 1 осуществляет цикл связывания – освобождения субстратных полипептидов. Обмен АТФ – FLA действует как переключатель конформации Hsp70 до того, как полипептид приобретает свёрнутую форму и шаперон перестаёт его узнавать в качестве субстрата, или до того, как CHIP связывается с комплексом Hsp70 – субстрат. Bag – 1 индуцирует освобождение субстратного пептида из молекулы Hsp70 зависимым от АТФ образом. В то же время CHIP поддерживает шаперон в АТФ – связанном состоянии и каталмзирует убиквитинилирование субстратного белка, отходящего от Hsp70 при содействии Bag – 1.