Применение генной инженерии для селекции ячменя

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ  бюджетное ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОфессионального образования 

«омский государственный  аграрный уНИВЕРСИТЕТ 

им. П.А. Столыпина»

(ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина)

 

 

Агрономический факультет

Кафедра селекции, генетики и физиологии растений

 

110400.68 – Агрономия

 

 

 

Реферат

по дисциплине «Сельскохозяйственная  биотехнология»

 

 

               Тема: Применение генной инженерии  для селекции ячменя

 

 

 

 

 

 

 

Выполнил: студент   группы агрономического факультета Проверил: профессор

 

 

Омск-2012 

1. Молекулярная генетика и биотехнология в селекции ячменя

Современные достижения в  области генной биоинженерии, биотехнологии и молекулярной генетики открывают еще недавно невозможные способы их применения в селекции. Для селекции растений особо перспективным является использование молекулярных маркеров при выведении новых сортов и возможность вводить в геном ячменя совершенно новые гены.

Маркер - легко распознаваемый признак, состоящий в тесной связи  с тем геном, который находится  в центре внимания селекционера. Отбор  растений, имеющих соответствующий  маркер, обеспечивает тем самым и  отбор по принципу присутствия нужного  гена. В прошлом в селекции использовались некоторые морфологические маркеры  и маркеры, основанные на полиморфизме основных белков (гордеинов) или некоторых ферментов (например, эстераз). Но возможности подобных методов ограничены. Только развитие молекулярной генетики принесло в этом направлении существенные перемены.

Носителями наследственной информации являются молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), различимые в растительной клетке как хромосомы. Двойной виток  ДНК образуют цепочки нуклеотидов, содержащих пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (тимин и цитозин) основания. Последовательность этих четырех оснований в молекулах ДНК кодирует отдельные аминокислоты и их соединение в молекулы белка -генные продукты, которые управляют метаболизмом отдельных клеток и всего растения. Генетическая информация размещена в молекуле ДНК линейно в отдельных генах с разными функциями. На сегодняшний день известно точное расположение большого количества генов, кодирующих самые разные признаки и свойства ячменя. С помощью разных методов можно детально проанализировать короткие специфические отрезки ДНК ячменя и определить их точную локализацию и структуру. Для целей селекции большое значение имеет полиморфизм ДНК, т.е. разница в структу-ре взаимно соотносящихся от резков ДНК у разных сортов (ли ний). Если такое отличие между двумя генотипами существует, сорта можно различить на ос нове этих отрезков ДНК. Молекулярные (или ДНК) маркеры -это короткие отрезки дезоксирибонуклеиновой кислоты, отличающиеся полиморфизмом, находящиеся в тесной связи ( генетической связи) с геном, отвечающим за нужный признак Так как такой маркер и ген, тесно с ним связанный, наследуются вместе, присутствие маркера сигнализирует также и при отсутствии данного гена. Если мы отбираем растения с соответствующим маркером, то получаем растения и с соответствующим нужным нам геном. Этот метод называется селекцией помощью маркеров (marker assisted selection, MAS). Присутствие маркеров проверяется на ДНК, взятой из растения, достаточно бывает, например, небольшой части листа. Собственно анализ проводят на специальных приборах, и он в значительной степени автоматизирован.

Метод MAS применим при селекции самых разных признаков и свойств. Условием для его использования является знание генетической зависимости признака, локализации соответствующего гена или генов в хромосоме и существование, также доступность соответствующего маркера. У признаке за которые отвечает один ген, использование MAS очень просто, но в случае с количественными признаками, за которые отвечают несколько генов, складывается совершенно иная ситуация. Было установлено, что гены, определяющие один количественный. признак, бывают сгруппированы в хромосоме одном или нескольких коротких отрезках, блоках, так называемых локусах количественных признаков (quantitative trait locus, QTL). Гены в этих блоках находятся друг с другом в генетической связи, потомству они передаются в совокупности, поэтому в этом случае также возможно использование MAS. В обзоре, фигурировавшем на веб-странице Barley Genomics (Washington State University, Pullman WA), на конец апреля 2003 г. приведен список почти 1800 генов и маркеров, локализованных в геноме ячменя. Общий обзор современного состояния MAS и сравнение его с конвенциональными методами селекции опубликован в работе Thomas.

Возможностям применения MAS в селекции и связанным с  этим методическим вопросам уделяется сейчас большое внимание. Были локализованы гены и QTL разных агрономических свойств, урожайности, характера зерна и других признаков. В широком масштабе маркеры используются при селекции устойчивости к болезням - мучнистой росе, бурой ржавчине, сетчатой пятнистости, ринхоспориозу, фузариозу и вирусам. Среди большого количества публикаций на эту тему мы приводим только некоторые. Большие возможности предоставляет использование MAS в селекции солодовых свойств. Большинство признаков солодовых свойств имеет полигенный характер, на экспрессию их QTL в определенной степени влияют условия среды. Отбор по количественным признакам уже по своей сути затруднителен, у качественных параметров солода на это часто накладываются затраты времени и средств на лабораторные анализы, поэтому в этой области MAS имеет большие перспективы. Генотип в большей или меньшей степени может влиять на следующие этапы технологического процесса производства солода и пива: замачивание, проращивание, сушка, затирание и фильтрация сусла. В этой же работе приведен обзор известных маркеров следующих солодовых свойств: содержания белка в зерне, массы, вида, твердости, длины и толщины зерна, белка в солоде, бета-глюкана, а-амилазы, диастатической силы и экстракта. Суть процесса соложения заключается в разложении полисахаридов и белков гидролитическими ферментами, и от результатов этого гидролиза зависит качество солода. Функции отдельных ферментов имеют простую генную кодировку, и много генов, управляющих их активностью, уже было локализовано, и для них можно найти и соответствующие ДНК маркеры. Гены Ату1 и Ату2 (бета-ами-лазы) находятся в хромосомах 7Н и 6Н, Вту1 и Вту2 (бета-амилазы) - в 4Н и 6Н, Agl (бета-глюкозидаза) - в 7Н, LD (ли-мит-декстриназа) - в 7Н, Gib- гены (бета-глюконазы) - Glb1 в 5Н, Glb2 в 7Н, семейство Glb31 -Glb37 - в ЗН. Ферментативная система, восстанавливающая основные белки ячменя до пептидов и аминокислот, очень сложна, в ней присутствует большое число ферментов - эндопротеиназ и экзопептидаз. Обзор 181 маркера разных солодовых свойств приведен в работе Хейса и др. Hartl и др. обнаружили ряд QTL числа Хар-тонга, индекса солодовых свойств, твердости зерна, грубого белка, растворимого азота, фриабильности, вязкости и конечной степени сбраживания. Коллинз и др. открыли значительный отрезок в хромосоме 2Н, в котором находятся QTL экстракта, а также процентной доли оболочки и энергии прорастания. В центре этого отрезка находится маркер XPSR108, который мог бы использоваться в селекции солодовых свойств. Маркес-Кадильо и др. исследовали локализацию QTL содержания белка в зерне, растворимого азота, активности бета-амилазы, диастатической силы и экстракта. Аюб и др. описывают возможность использования MAS в селекции по QTL высокой активности а-амилазы. Хан и др. локализовали три QTL содержания бета-глюкана в зерне ячменя, шесть QTL содержания бета-глюкана в солоде, три QTL бета-глюконазы в зеленом солоде и пять QTL бета-глюконазы в готовом солоде. Такафуни Канеко и др. обнаружили QTL активности бета-амилазы в хромосомах 1Н, 2Н и 5Н, QTL термостабильности был найден в хромосомах 4Н и 2Н. Li и др. локализовали гены Вгпу1 и ВгпуЗ в хромосоме 4Н и ген Вту2 в хромосоме 2Н. ДНК-маркеров разных признаков и свойств ячменя уже известно очень много, и их число все время растет. Но каково нынешнее практическое применение ДНК-маркеров в селекции ячменя? Ситуация ясна для признаков, за которые отвечает один ген, в этом случае надежность применения ДНК-маркеров достаточно высока. Ограничивающим фактором пока являются довольно высокие расходы на оборудование и эксплуатацию соответствующих лабораторий, поэтому использование MAS рентабельно прежде всего для тех признаков, определение которых классическими методами трудоемко и дорого. Преимуществом MAS является возможность его использования уже в первых поколениях и селекция по принципу одновременного присутствия нескольких генов. Хорошее применение может найти MAS для существенного сокращения цикла обратного скрещивания. Достоинства метода проявляются в селекции устойчивости к некоторым болезням, таким как фузариоз, сетчатая пятнистость или желтая вирусная карликовость. Тестирование детерминированной одним геном устойчивости к мучнистой росе с помощью инфицирования молодых растений в парнике является простым и быстрым методом, а потому селекция с использованием MAS была бы неэкономичной. Однако в некоторых целях при селекции устойчивости к этой болезни MAS может быть незаменим, например, в случае сочетания множества разных генов устойчивости (например, mlo и некоторых новых алелей Mia из Н. spontaneum) в одном генотипе. Одновременное присутствие обоих генов нельзя распознать обычным способом тестирования. Иная ситуация складывается при использовании MAS для признаков, за которые отвечают несколько генов. Локализовать QTL и выделить QTL- маркер в этом случае гораздо труднее, чем в случае с моногенно детерминированными признаками. Однако самую большую проблему составляет тот факт, что локализация найденных QTL действительна в большинстве случаев только для данной популяции, полученной от определенной родительской пары, и соответствующие маркеры нельзя применить для селекции в другой популяции. Поэтому пока использование MAS для количественных признаков в практических селекционных программах ограничено. Ограничивающим фактором является и то обстоятельство, что над локализацией генов и выделением маркеров работают в том числе и частные исследовательские фирмы и лаборатории, результаты их труда не всегда публикуются или публикуются лишь частично и с опозданием. Когда же найденные маркеры становятся общественным достоянием, то они уже защищены патентом.

 

2. Трансгенез в селекции ячменя

Под трансгенезом понимается внесение чужеродных генов в геном. С помощью этой технологии можно добавить к генетической информации ячменя новый ген, взятый у растений других родов и видов, а при необходимости и у совершенно иного организма. Таким образом генетический набор ячменя можно дополнить генами совершенно новых признаков и свойств, которые нельзя найти в рамках рода или вида и которые поэтому нельзя ввести в геном конвенциональными методами - скрещиванием. Для трансгенеза используется несколько разных техник, чаще всего введение чужеродной ДНК в клетку с помощью микроинъекции или с помощью бактерии Agrobacterium tumefaciens. Первую стабильную трансформацию ячменя удалось осуществить в 1994 г. Ткани ячменя (зародыш, каллусы) бомбардировали микроинъекциями, представлявшими собой микроскопические шарики инертного металла (золота, вольфрама) размером около 1 мкм, которые были погружены в раствор векторной ДНК и потом высушены, так что ДНК оставалась на их поверхности. В клетки они выстреливались с помощью различного оборудования под высоким или, наоборот, под низким давлением. Далее клетки выращивали в тканевых культурах, где сначала образовывались каллусы, а в следующей фазе происходила регенерация растений. При использовании этого метода вносимая ДНК должна содержать селективный ген, который в среде, состоящей из агара с селективным веществом, обеспечивает выживание только трансгенным клеткам. Метод пока еще имеет ряд недостатков и постоянно совершенствуется. Он имеет целью добиться эффективного производства трансгенных растений у всех сортов, поместить в выбранный геном только небольшое количество копий гена, свести к минимуму нарушения в геноме и добиться стабильной экспрессии трансгенов [84]. Agrobacterium tumefaciens - почвенная бактерия, которая способствует образованию наростов на корнях некоторых двудомных растений. Она отличается способностью вносить свои специфические гены, локализованные в части ДНК, обозначаемой как1-ДНК (transfer DMA), в геном клетки растения-хозяина. Речь идет о генах, отвечающих за синтез растительных гормонов и специфических веществ наростов (опины), служащих источником углерода, азота и энергии для самой бактерии. Для целей трансгенеза t-ДНК модифицирована так, что исходные гены в ней замещены теми генами, которые нужно перенести, и другими вспомогательными генами, обеспечивающими селекцию трансформированных генотипов в тканевой культуре, а также генами, регулирующими экспрессию трансгена. Растения, полученные в результате регенерации из тканевых культур, содержат в своем геноме необходимый трансген. В селекции гомозиготных трансгенных растений используются молекулярные маркеры и разные ферментные системы. Использование Agrobacterium tumefaciens у однодомных растений первоначально было сопряжено с большими проблемами. Уже достигнуты успехи в отношении риса, кукурузы, пшеницы и ячменя, но до решения всех проблем еще очень далеко. Положительной стороной данного метода является относительно высокая частота получения трансгенов, малое число копий трансгена и почти нулевая полиплодия. Но в целом процедура эта трудоемка и длительна (10 месяцев до получения зерна), ее успешность сильно зависит от сорта, встречаются соматические мутации клонов или другие генные повреждения. По-видимому, самым значительным практическим результатом трансгенеза являются полевые культуры, резистентные действию неселективных гербицидов  или к разным болезням и вредителям. Так: используются или в перспективе будут использоваться трансгены, меняющие химический состав белков и липидов, трансгены, увеличивающие срок хранения плодов томата и срезанных цветов, трансгены для синтеза вакцин и других используемы фармакологии веществ, ферментов, биоразлагающихся эфиров, трансгены, модифицирующие развитие растений, цветков, содержание витаминов и т.д. Punja обобщает с стояние и перспективы трансегенеза с точки зрения устойчивости к грибковым заболеваниям. Обзор сведений об использовании трансгенеза у ячменя опубликован в работах: Lemaux и др., Horvath и др. Уже были получены трансгенные растения, устойчивые к фузариозу или растения с трансгенами, которые активируют токсины фузарий. Большие возможное дает использование трансгенеза для улучшения солодовые свойств. Некоторые обнадеживающие результаты уже были получены, например, в геном ячменя были введены гены, погашающие активность а-амилазы, глюкозидазы и термостабильность р-глюканазы. Об успешном введении трансгена термостабильной р-глюканазы опубликованы работы и других торов, например, Nuutila и др. и т.д. Интересный эффект дает трансген тиоредоксина h, взятый из генома пшеницы, оредоксин h - фермент, регулирующий мобилизацию источников азота и углерода в эндосперме зерен пшеницы при проращивании и росте проращиваемых растений. Этот трансгенез внесенный в ячмень, оказал положительное влияние на энергию прорастания, увеличил количество растворимого азота, повысил скорость синтеза амилазы и в четыре раза увели активность предельной декстриназы. Ведется интенсивная работа по повышению солодовых свойств с помощью транс нов, влияющих на метаболизм в процессе проращивания, был опубликован целый ряд полученных результатов, Практическое использование трансгенеза ячменя проводится в самом начале, и необходимо преодолеть есть масса преград на этом пути. Требуется повысить производительность трансгенных растений, обойтись без маркеров, ос ванных на чувствительности к антибиотикам или гербицид преодолеть зависимость процентной доли получаемых трансгенных растений от генотипа, сделать возможным направленное введение трансгена в определенное место генома, совершенствовать возможность регулирования экспресс трансгенов, снизить частоту соматических мутаций клоне т.д. Вложенные трансгены влияют не только на один признак, но в зависимости от генофонда меняют много метаболических процессов в клетке, имеют плеотропический эффект итоговый результат трансгенеза бывает трудно предсказать. Особенно важно влияние трансгенов на урожайность зерна и другие сельскохозяйственные свойства ячменя. На сегодняшний день информация об этом в значительной степ разнится. Harwood и др. обнаружили у протестирован трансгенных линий более короткий стебель, а у некоторых линий - более позднее цветение, но различий в составляющих урожайности или в урожайности с участка обнаружено не было. Напротив, Bregitzer и Halbert у большинства из 44 линий, полученных из 15 независимых трансформаций, зафиксировали уменьшение высоты стебля, жизнеспособности и урожайности зерна. Подобные разнящиеся результаты можно найти и у других авторов.

Трансгенез в будущем предоставит огромные возможности для улучшения всех важных признаков и свойств ячменя. Однако нужно учитывать, что внесение чужого гена в сбалансированный геном может повлиять на многие метаболические процессы и фенотипические проявления, что растение обладает большими способностями компенсации изменения одного признака за счет изменений других признаков, и что реализация генетического потенциала признаков зависит от взаимодействия генотипа со средой. Поэтому полученные трансгенные растения можно считать исходным материалом для дальнейшей селекции стабильных генотипов, в которых трансген будет находиться в полном единстве со всем генофондом. Только так можно будет получить трансгенные сорта с удовлетворительными сельскохозяйственными свойствами.

При использовании трансгенных сортов на практике решающим фактором будет, примет ли потребитель такие сорта и произведенные из них продукты. Это относится ко всем продуктам, а для такого традиционного продукта, как пиво, это значимо вдвойне. Распространенная сейчас во всем мире дискуссия о генетически модифицированных организмах (GMO), часто ведущаяся с ненаучных позиций по обеим сторонам баррикады, вызывает всеобщие сомнения в безопасности GMO с медицинской точки зрения и с точки зрения их влияния на окружающую среду. Черно-белое восприятие проблемы не приводит к ее решению, нужно учитывать, что ни одна технология не является совершенной, она всегда имеет свои преимущества и недостатки, и нужно реалистично взвесить все «за» и «против». Нельзя отвергать или, наоборот, преувеличивать значение биотехнологии как таковой. Конечно, биотехнология уже принесла выдающиеся результаты: устойчивость к болезням и вредителям привела к снижению потребления пестицидов, устойчивость к гербицидам как таковым, способствовала снижению потребления отдельных гербицидов, выведен «золотой рис» с повышенным содержанием предшественника витамина А. Перспективы дальнейшего улучшения потребительских свойств растений также неограничены. Возможные риски в каждом конкретном случае применения трансгенной технологии должны быть объективно и всесторонне изучены. Только если исключены какие-либо негативные последствия для здоровья человека или экологии, в практику возделывания, переработки и потребления можно вводить новые сорта, несущие в своем геноме трансгены.