Противовирусная активность препаратовт полипренол и воспренил в отношении вируса ИРТ КРС

3.1 Вирус и культура клеток.

В опытах использовали вирус ИРТ КРС (штамм ТК-А), полученный из ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. Инфекционную активность вируса определяли в чувствительных перевиваемых линиях культур клеток почки теленка (МDВК). В качестве ростовой среды использовали питательную среду Игла МЕМ с однократным и двойным набором аминокислот и витаминов с добавлением 5 – 10% фетальной сыворотки фирмы «BioClot» (Германия), тестированной на наличие вируса ИРТ КРС и антител к нему, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 37оС и 5% СО2. В качестве поддерживающей среды использовали ту же среду, но без сыворотки.

3.2 Препараты.

В работе использовали препараты: Полипренол в виде водно-эмульсионной формы, его производное Фоспренил производства ЗАО «Микро-плюс» при НИИ эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН серии 1056-1058 в виде 0,4%-го раствора полипренилфосфатов в комплексном водном растворителе.

3.3 Определение токсичности препаратов в культуре клеток.

Токсичность препаратов оценивали путем добавления их разведений   в среде ИГЛА МЕМ к монослою клеточной культуры МДВК, выращенной микрометодом в лунках 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 5-2000 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37ºС  в СО2-инкубаторе в течение 5 суток.

Контролем служили клетки без добавления исследуемого соединения. Жизнеспособность клеток оценивали  после окрашивания 1% раствором трипанового синего, приготовленного на фосфатном буфере рН 7,2-7,3. Через 5 минут внесения краски подсчитывали количество живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в голубой цвет) клеток в камере Горяева и по формуле определяли количество клеток в 1 мл, учитывая кратность разведения клеточной суспензии раствором краски. Токсичность различных доз соединений определяли по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам рассчитывали дозу, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD50).

3.4 Определение ингибирующего эффекта препарата.

Ингибирующий эффект препарата оценивали на 4-е сутки культивирования по ЦПД вируса, исходя из степени защиты инфицированных клеток подсчетом в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. На основании полученных результатов рассчитывали количественные характеристики ингибирования репродукции вируса ИРТ КРС: ID50 – концентрацию препарата, на 50% подавляющую продукцию вируса.

3.5 Определение противовирусной активности.

Монослой культуры клеток заражали вирусом ИРТ в дозе не менее 1 ТЦД/кл,  через 1,5 часа после этого их отмывали питательной средой без сыворотки и вносили препарат в эффективной дозе или разводящую среду (контроль). Через 72 часа культивирования вируса в таких биосистемах культуральную жидкость титровали. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по соотношениям инфекционных активностей вирусов в опытных и контрольных образцах.  В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препаратов.

3.6 Титрование вируса.

Определение инфекционного титра вируса ИРТ проводили микрометодом  в 96-луночных культуральных планшетах (Costar) с культурами клеток MDBK с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД50/мл (50%-я тканевая цитопатическая доза).

Все опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами, оценивая доверительный интервал для 95%-й вероятности.

4. Результаты

Результаты исследований по определению цитотоксичности препаратов представлены в таблице 1 и 2.

Таблица 1. Определение токсичности препарата  полипренол в культуре клеток МДВК

Таблица 2. Определение токсичности препарата  фоспренил в культуре клеток МДВК

В результате проведенных экспериментов установлены цитотоксические дозы для полипренола и фоспренила, которые составили  соответственно –50 и 500 мкг/мл (CD50). Полученные данные свидетельствуют о снижении  токсичности у препарата  фоспренил в 10 раз по сравнению с полипренолом.

Результаты исследований по определению противовирусного действия препаратов в отношении вируса ИРТ КРС представлены в таблице  3.

Таблица 3. Определение противовирусной активности препаратов

полипренол и фоспренил в культуре клеток

Примечание: различия между контролем и соответствующими показателями в указанных случаях статистически достоверны с вероятностью 95%.

Полученные результаты  свидетельствуют о том, что  испытанные препараты в значительной степени подавляли репродукцию вируса ИРТ КРС  в чувствительной культуре клеток.

Полипренол подавлял репродукцию вируса на 3,5 lg.ТЦД50/мл, а  фоспренил – на 3,91 lg.ТЦД50/мл по сравнению с контролем.

При определении 50% ингибирующих концентраций изучаемых препаратов в культуре клеток MDВK они составили для полипренола - 25 мкг/мл,  фоспренила - 200 мкг/мл. Более выраженная токсичность полипренола может быть связана с методом его получения и по всей вероятности может варьировать в каждой новой  серии препарата.

Сравнительное изучение противовирусной активности фоспренила  и полипренола в опытах in vitro  на модели вируса ИРТ КРС показало, что он обладает более выраженной противовирусной активностью. Кроме того, у него установлено вирулицидное действие в отношении вируса ИРТ КРС. Препарат вызвал статистически достоверное снижение инфекционной активности вируса на 2,17 lg ТЦД50/мл.

5. Заключение

В опытах in vitro  на модели вируса ИРТ КРС проведено сравнительное изучение противовирусной активности препаратов полипренол и фоспренил. В результате проведенных исследований установлено, что фоспренил обладает вирулицидной и  выраженной противовирусной активностью в отношении вируса ИРТ КРС.

Список использованных источников

1.                  Бирман Б.Я., Наттиева Т.Г., Захарик Н.В. Новые антивирусные препараты в профилактике и лечении смешанных респираторных заболеваний телят и птиц/ Актуальные проблемы ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации животноводства. - МВА, 1990.-с.127-128.

2.                  Вирусные заболевания крупного рогатого скота в Сибири и на Урале (Особенности эпизоотологии, клинического проявления, диагностика, меры профилактики и борьбы): Методические рекомендации / РАСХН, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 2001.-25 с.

3.                  Жданов В.М., Баринский И.Ф., Ершов Ф.И., Нестерчук С.Л. Иммуномодуляторы и химиопрепараты в терапии синдрома приобретенного иммунодефицита // Вопросы вирусологии, 1987. - №1. С. 6-11.

4.                  Ожерелков С.В., Белоусова Р.В., Данилов Л.Л. и др. Препарат фоспренил подавляет размножение вирусов диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в чувствительных культурах клеток // Вопросы вирусологии, 2001. - №5. С. 43-45.