Биохимия

     Содержание 
 

     1. Охарактеризуйте особые приемы, используемые для выделения ферментов и объясните, чем это обусловлено 

     Основной  составной частью сока поджелудочной  железы являются ферменты. К ним  относятся: 1. Протеиназы : трипсиноген, химотрипсиноген, карбоксипептидаза, аминопепсидаза, коллагеназа, элластаза; 2. Липаза (экстераза); Нуклеазы: рибонуклеаза, дозоксирибонуклеаза; 3. Карбогидразы: амилаза, мальтаза, лактаза. В состав панкреатического сока входят органические (ферменты, альбумины, глобулины ) и неорганические вещества ( карбонаты и бикарбонаты Na, K, Ca, Mg, P ). В 1000 мл. сока содержится 5-6 г. общего белка, 35-97 мг.хлорида, 30-74 мг.двууглекислого натрия, 134-142 мг.натрия, 4,7-7,4 мг.калия и 2-3 мг. Поджелудочная железа вырабатывает и антиферменты (ингибиторы ферментов), принимающие участие в регуляции активности панкреатического сока. Ферменты образуются в ацинарных клетках, жидкая часть сока и электролиты вырабатываются клетками протоков, а мукоидная жидкость - слизистыми клетками главного протока. Из клеток ферменты поступают в межклеточные пространства дольки, в систему протоков, а также в кровь.

     Ферменты, поступающие в кровь, в нормальных условиях держатся на постоянном уровне. Они выполняют ряд важных функций. Так, трипсиноген принимает участие  в регуляции свертывающей системы крови, амилаза принимает участие в углеводном обмене, а липаза - в жировом. Активность амилазы крови меняется в связи с приемом пищи. Островки Лангерганса продуцируют инсулин и его антогониста глюкагон.

     Инсулин вырабатывается бета-клетками. Поджелудочная железа продуцирует еще два гормона - липокаин и калликреин. Количество и состав панкреатического сока зависят от характера пищи, гуморальных и нервных раздражителей. Установлено, что раздражение блуждающего и чревных нервов вызывает выделение небольшого количества панкреатического сока, богатого ферментами и белками. Раздражение симпатического нерва тормозит секрецию поджелудочной железы. Поступление в двенадцатиперстную кишку желудочного сока, содержащего соляную кислоту, и других кислот резко возбуждает выделение панкреатического сока, что объясняется образованием в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки секретина (одновременно стимулирует образование желчи, кишечного сока и сокращение желчного пузыря ) и панкреозимина. Секретин вызывает выделение жидкой части поджелудочного сока и бикарбонатов, а панкрезимин стимулирует секрецию и выделение ферментов. Установлено, что секретин стимулирует функцию поджелудочной железы и рефлекторно через сосудистые рецепторы, а потому под влиянием внутривенного вливания раствора новокаина, выключающего сосудистые рецепторы, действие секретина резко снижается. 

     2. Найдите способ  определение содержание  аминокислот триптофана  и цистеина в  составе белков. Напишите  соответствующие  уравнения реакций 

     При выборе протеолитических ферментов, подходящих для избирательного гидролиза белка, особенно, важна их специфичность. Как правило, пользуются так называемой первичной специфичностью протеиназ, т.е. их способностью преимущественно атаковать пептидные связи, образованные тем или иным аминокислотным остатком. Аминокислотные остатки субстрата принято обозначать латинской буквой Р с индексами, соответствующими номеру остатка, считая от расщепляемой связи к аминному концу («влево»). Остатки, расположенные в сторону карбоксильного конца («вправо» от гидролизуемой связи) обозначают Р' с соответствующим индексом:

     Если  использовать эти обозначения, то первичной  специфичностью следует считать способность той или иной протеиназы избирательно расщеплять пептидные связи, образованные остатками Р₁ и Р₁'. Все протеиназы, однако, имеют более или менее выраженную вторичную специфичность: скорость расщепления ими пептидной связи зависит не только от строения той аминокислоты, которая прямо участвует в ее построении своей карбоксильной или аминной группой (т.е. остатка Р₁ и Р₁'), но и от соседних аминокислотных остатков Р₂, Р₃, Р₂', Р₃' и т.д. Обычно в образовании комплекса с ферментом участвует не менее 5—6 аминокислотных остатков.

     Влияние вторичной специфичности уменьшают, проводя гидролиз достаточно долго, так, чтобы расщепились и те пептидные связи, которые находятся в невыгодном для данного фермента окружении. Специфичность протеиназ редко бывает совершенно строгой: наблюдается и расщепление не характерных для данного фермента связей, нарастающее со временем. Все это требует оптимизации условий ферментативного гидролиза полипептидных цепей.

     В настоящее время для специфического гидролиза белков при определении  первичной структуры наиболее часто применяют следующие протеиназы.

     Трипсин. Это фермент поджелудочной железы животных, который принадлежит классу так называемый сериновых протеиназ и специфически гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков аргинина или лизина (Р₁ = Arg, Lys). Боковые цепи этих аминокислот несут на определенном расстоянии от о-углеродного атома положительно Заряженную катионную группу . Показано, что в зоне связывания субстрата последняя входит во впадину , где расположена отрицательно заряженная b-карбоксильная группа одного из остатков аспарагиновой кислоты трипсина:

     Электростатическое  взаимодействие между катионной и анионной группами играет определяющую роль в специфичности трипсина. Это подтверждается тем, что замена аспарагиновой кислоты в зоне связывания субстрата другим остатком приводит к утрате способности гидролизовать пептидные связи аргинина или лизина.

     Блокирование  ε-аминогрупп лизина в атакуемом  трипсином полипептиде, например ацилированием цитраконовым ангидридом (см. гл. 9), приводит к замене катионной аминогруппы на анионную (карбоксилатную), поэтому в соответствующем производном трипсин расщепляет только пептидные связи аргинина. Это позволяет получить более крупные фрагменты белка, которые после их выделения из гидролизата выдерживают в слабокислом растворе, что вызывает отщепление остатка цитраконовой кислоты и высвобождение e-аминогрупп лизина. Затем такие пептиды с регенерированными остатками лизина вновь расщепляют трипсином.

     Аналогично  можно регулировать доступность  пептидных связей аргинина гидролизу трипсином. Для этого блокируют гуанидогруппу аргинина, обрабатывая белок в щелочной среде дикетоном, например диацетилом, закрепляя образующийся при этом диол образованием комплекса с борной кислотой.

     При гидролизе белка трипсином обычно используют рН, близкий 8, температуру 37 °С и весовое соотношение фермент — субстрат 1:100, регулируя полноту гидролиза временем реакции. Нередко при гидролизе трипсином расщепляются отдельные пептидные связи, соответствующие специфичности родственного фермента — химотрипсина. Это может объясняться присутствием в препарате трипсина примеси химотрипсина или продуктов ограниченного гидролиза трипсина, однако и - вполне чистый трипсин может сам по себе обнаруживать не характерную для него специфичность.

     Химотрипсин. Сериновая протеиназа поджелудочной железы, структурно родственная (гомологичная) трипсину. Химотрипсин специфически гидролизует (оптимум рН вблизи 8) пептидные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина, триптофана и нередко лейцина, сравнимого с этими остатками по гидрофобности (Р₁ = Phe, Т уr, Тrр, Leu).

     Термолизин. Металлопротеиназа, секретируемая клетками термофильной бактерии Bacillus amyloliquefaciens. Этот фермент, имеющий ион цинка в актив ном центре, оптимально активен при рН 6—8 и избирательно гидролизует пептидные связи, образованные с участием аминогрупп гидрофобных аминокислот — лейцина, фенилаланина, тирозина, валина, изолейцина (Р₁' = Leu, Phe, Т уr, Val, Ile). Фермент может применяться даже при 60—80оС.

     Glu, Asp-специфичные протеиназы (эндопротеиназы Glu—С). Сериновые протеи-назы Staphylococcus aureus, а также некоторых стрептомицетов и термоактиномицетов. Ферменты гидролизуют пептидные связи, образованные a-карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты, значительно реже аспарагиновой кислоты (Р ₁ = Glu, Asp). Имеют в зависимости от субстрата и состава буферного раствора два оптимума рН: при 4 и 8. Характерная для этих протеиназ и весьма строго выдерживаемая специфичность хорошо дополняет специфичность других протеолитических ферментов, поэтому они все шире применяются в анализе структуры.

     Эндопротеинза Lys-C. Протеолитический фермент из Lysobacter enzymo-genes, специфически гидролизующий пептидные связи, образованные карбоксильной группой лизина, но не аргинина (Р₁ = Lys).

     Эндопротеиназа  Arg-C. Протеиназа из подчелюстной железы мыши, избирательно расщепляющая пептидные связи, образованные с участием карбоксильной группы аргинина (Р₁ = Arg).

     Можно предполагать, что будут найдены и войдут в практику фрагментации белков и другие протеолитические ферменты с четко определенной специфичностью. 
 

     3. К какой группе  белков по функциональной  активности относятся  сывороточный альбумин и токсины? В чем специфика строения этих белков? 

     Реакцию переноса ADP-рибозного фрагмента катализируют некоторые бактериальные токсины. Каталитический домен дифтерийного токсина, образующийся в результате ограниченного протеолйза, катализирует присоединение этого фрагмента к фактору элонгации EF-2 в клетках эукариот и архе-бактерий. Модификации подвергается производное гистидина (содержащееся в консервативном районе последовательности этого фактора) - дифтамид, в свою очередь образуемый многоступенчатой модификацией остатка гистидина.

     На  первом этапе аденозилметионин (AdoMet), обычно являющийся донором метильной группы, выступает при алкилировании имидазольного кольца как донор фрагмента:

     Затем происходит исчерпывающее метилирование  аминогруппы присоединившегося фрагмента. В этом случае аденозилметионин является источником метильных групп, превращаясь в аденозилгомоцистеин (AdoHcy). Модификацию завершает амидирование карбоксильной группы, которое протекает с одновременным гидролизом АТР и приводит к дифтамиду:

     ADP-рибозилирование дифтамида, катализируемое дифтерийным токсином, инактивирует фактор элонгации EF , прерывая тем самым трансляцию, что приводит к гибели клетки. 

     4. Дайте сравнительную  характеристику всех  видов РНК. Оформите  ответ в виде  таблицы, указав  малярную массу,  минорные основания, углеводы, структуру, место локализации, функции 

     О количестве РНК нет точных данных, поскольку содержание ее в разных клетках в значительной степени  определяется интенсивностью синтеза  белка. На долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки. Современная классификация различных типов клеточной РНК основывается на данных топографии, функции и молекулярной массы. Выделяют три главных вида РНК: матричную (информационную) – мРНК, которая составляет 2–3% от всей клеточной РНК; рибосомную – рРНК, составляющую 80–85% и транспортную – тРНК, которой около 16%. Эти 3 вида различаются нуклеотид-ным составом и функциями (табл. 1). 
 
 
 
 
 

     Таблица 1.

     5. Фермент лактатдегидрогенеза  окисляет молочную  кислоту в пировиноградную.  Покажите с помощью  уравнения данной реакции механизм действия кофермента НАД 

     Окисление пирувата до ацетил-КоА происходит при участии ряда ферментов и  коферментов, объединенных структурно в мультиферментную систему, получившую название «пируватдегидрогеназный  комплекс».

     На I стадии этого процесса пируват теряет свою карбоксильную группу в результате взаимодействия с тиаминпирофосфатом (ТПФ) в составе активного центра фермента пируватдегидрогеназы (E1). На II стадии оксиэтильная группа комплекса E1–ТПФ–СНОН–СН3 окисляется с образованием ацетильной группы, которая одновременно переносится на амид липоевой кислоты (кофермент), связанной с ферментом дигидроли-поилацетилтрансферазой (Е2). Этот фермент катализирует III стадию – перенос ацетильной группы на коэнзим КоА (HS-KoA) с образованием конечного продукта ацетил-КоА, который является высокоэнергетическим (макроэргическим) соединением.

     На IV стадии регенерируется окисленная форма  липоамида из восстановленного комплекса  дигидролипоамид–Е2. При участии  фермента дигидролипоилдегидрогеназы (Е3) осуществляется перенос атомов водорода от восстановленных сульфгидрильных групп дигидролипоамида на ФАД, который выполняет роль простетической группы данного фермента и прочно с ним связан. На V стадии восстановленный ФАДН2 дигидро-липоилдегидрогеназы передает водород на кофермент НАД с образованием НАДН + Н+.