Оздоровление посадочного материала в культуре апикальных меристем

     Для формування ембріонів необхідно  зменшувати концентрацію ауксину або повністю його виключати зі складу поживного середовища. Соматичний ембріогенез можна спостерігати безпосередньо в тканинах первинного експланту, а також в калюсній культурі. Причому останній спосіб менш придатний при клональному мікророзмноженні, оскільки посадковий матеріал, отриманий таким методом, буде генетично нестабільний у відношенні до рослин-донорів. Як правило, соматичний ембріогенез відбувається при культивуванні калюсних клітин в рідкому поживному середовищі (суспензії) і є найбільш трудомісткою операцією. Проте цей метод розмноження має свої переваги, пов'язані із скороченням останнього (третього) етапу клонального мікророзмноження, що не вимагає підбору спеціальних умов вкорінення і адаптації пробірних рослин, тому що соматичні зародки представляють собою повністю сформовані рослини. При використанні відповідної техніки їх капсулювання з цих ембріоїдів можливо отримувати штучне насіння.

     Четвертий метод клонального мікророзмноження – диференціація адвентивних бруньок в первинній і пересадковій калюсній тканинах. Практично він мало використовується в цілях отримання посадкового матеріалу in vitro. Це пов'язано з тим, що при періодичному пересаджуванні калюсної тканини на свіже поживне середовище часто спостерігаються явища, небажані при мікророзмноженні:

• зміна плоїдності культивованих клітин;
• структурні перебудови хромосом і накопичення генних мутацій;
• втрата морфогенетичного потенціалу культивованими клітинами.

      Разом з генетичними змінами спостерігаються зміни рослин і за морфологією:

• низькорослість;
• неправильне жилкування листя та їх розташування по стеблу;
• утворення укороченого, потовщеного міжвузля;
• потворність;
• знижена стійкість до хвороб і шкідників.

      Причому тривале культивування калюсних клітин посилює ці зміни, тому період неорганізованого росту при мікророзмноженні має бути зведений до мінімуму.

      Проте, не дивлячись на деякі недоліки, даний метод має свої позитивні сторони і переваги. По-перше, він являється ефективним і економічно вигідним, оскільки в процесі розмноження з кожної індивідуальної калусної клітини при визначених сприятливих умовах культивування може сформуватися адвентивна брунька, що дає початок новій рослині. По-друге, у ряді випадків він являється єдино можливим способом розмноження рослин в культурі тканин. По-третє – представляє великий інтерес для селекціонерів, оскільки рослини отримані даним методом, відрізняються один від одного генетично і морфологічно. Це дає можливість селекціонерам проводити відбір рослин за господарсько важливими ознаками і оцінювати їх поведінку

в польових умовах. Цей метод – доцільно застосовувати лише тим рослинам, для яких характерна генетична стабільність калюсної тканини, а варіантність між рослинами-регенерантами не перевищує рівня природної мінливості. До таких рослин можна віднести амариліс, драцени, томати, спаржу, деякі деревні породи та інші культури. Через калусну культуру були розмножені, цукровий буряк, деякі представники роду Brassica, кукурудза, рис, пшениця та інші злакові, соняшник, льон, розроблені умови, сприяючі регенерації рослин з каллусу огірка, картоплі, томатів. 

2. Фактори, що впливають на процес мікроклонального розмноження

     Найважливішим моментом є вибір материнської рослини  та експланту, а також стерилізація вихідного матеріалу.

     Вибір материнської рослини. Бажано, щоб вихідні рослини не були пошкоджені грибними, бактеріальними і вірусними хворобами. Цибулини, кореневища і бульби перед введенням у культуру in vitro попередньо обробляють високими або низькими температурами протягом різного часу – від кількох годин до кількох місяців

     Вибір експланту. Для забезпечення максимальної генетичної стабільності клонованого матеріалу і з метою уникнення появи аномальних рослин як вихідний експлант використовують молоді, слабкодиференційовані тканини. Для цього найпридатніші кінчики стебел, бічні (пазушні) бруньки, зародки та інші меристемні тканини. Можна використовувати молоді листки, черешки, суцвіття, луску, денце цибулин. Проте в цьому разі потрібен цитологічний і морфологічний контроль регенерантів.

    Стерилізація  вихідного матеріалу. Для знезаражування вихідних експлантів використовують загальноприйняті методики. Правильний вибір стерилізуючого засобу полягає в тому, щоб він згубно вплинув на всі мікроорганізми і в той же час якнайменше пошкоджував тканини рослинного організму. Актуальність цієї проблеми особливо виявляється при стерилізації об'єктів, які мають тріщини, пошкодження, заглиблення (наприклад насіння та плоди деяких видів). У цих випадках вимагається проведення не лише поверхневої стерилізації, а й глибоке проникнення стерилізуючого розчину, що може бути досить ризикованим для подальшого росту тканини.

    Наступною важливою умовою є те, що стерилізуюча речовина повинна легко вилучатися із тканини промиванням дистильованою  водою або піддаватися розкладу (в іншому випадку відбувається отруєння тканин). Тому для отримання позитивних результатів, як правило, користуються уже відомою технікою стерилізації даного об'єкту, або ж розробляють її експериментально для кожного конкретного випадку, оскільки один і той же орган у різних рослин вимагає різних умов стерилізації. При правильному виборі стерилізуючої речовини розмір інфікування тканин не перевищує 1 – 3 %.

    Гіпохлорит натрію (NaHClO) – застосовується для стерилізації насіння та інших рослинних тканин у вигляді 0,5 – 5 %-них розчинів протягом 1 – 20 хв. Використовують також комерційний препарат – 5,5 % розчин гіпохлориту натрію у воді (хлоракс), який містить сліди перманганату. Гіпохлорит натрію є отрутою для клітин, тому після проведення стерилізації цією речовиною необхідне ретельне промивання зразків стерильною дистильованою водою.

    Гіпохлорит кальцію (Са(НСlO)₂) – менш токсичний для тканин, ніж гіпохлорит натрію. Ця сполука знаходить широке застосування для стерилізації поверхні різних органів рослин: запасних тканин (бульб, коренеплодів), пагонів, насіння, коренів, бруньок, зав'язів, листків, суцвіття, плодів.

    Хлорне вапно - часто використовується для стерилізації рослинних об'єктів і складається із чистого гіпохлориту кальцію (70 % активного хлору), але може іноді містити незначну кількість основних солей кальцію.

    Пероксид водню (Н₂О₂) – в основному використовують для стерилізації насіння (здебільшого в концентрації 2 – 10 %), рідше – для стерилізації стебел і листків. Після стерилізації пероксидом водню не вимагається тривалого промивання тканин водою (достатнім є одноразове промивання). Пероксид водню, який залишився в тканинах, є не токсичним і швидко розкладається.

    Етиловий спирт (С₂Н₅ОН) – застосовується в концентрації 90 – 95 % для попередньої стерилізації об'єктів і покращення дії інших стерилізуючих засобів, а також для стерилізації плодів, насіння, пагонів, зав'язів.

    Антибіотики відносно нетоксичні для тканин рослин, однак рідко застосовуються для поверхневої стерилізації, оскільки межі їх бактеріологічної активності дуже обмежені. Додавання розчинів антибіотиків у поживне середовище може бути ефективним у тих випадках, якщо тканини неможливо простерилізувати звичайними засобами внаслідок інфікування їх внутрішніх областей спорами бактерій або грибів. З цією метою частіше використовують пеніцилін, стрептоміцин, біоміцин, тетрациклін, окситетрациклін, тераміцин, бацитрацин, ауреоміцин та інші.

    Оскільки  антибіотики є термолабільними  речовинами, їх стерилізують лише методом  фільтрування і додають до охолодженого середовища.

    При використанні антибіотиків для стерилізації необхідно ретельно підібрати концентрацію, яка б достатньо згубно діяла  на мікроорганізми, але не була токсичною для тканин (антибіотики в різних концентраціях можуть стимулювати або пригнічувати ріст ізольованих культур).

     Проте часто внутрішнє зараження вихідних експлантів буває набагато сильнішим, ніж поверхневе, тому експланти попередньо обробляються фунгіцидами й антибіотиками проти грибної та бактеріальної інфекцій. Хороші результати дає обробка рослинного матеріалу бензоатом натрію. Більш того, потрібен ретельний фітосанітарний догляд за вихідними рослинами. Залежно від виду рослин використовують як тверді, так і рідкі поживні середовища, горизонтальне або вертикальне розташування експланту на поживному середовищі, також слід встановлювати оптимальне співвідношення обсягу експлантів і кількості поживного середовища, умови оптимального освітлення і газообміну експлантів. Методика мікроклонального розмноження докладно розроблена для багатьох видів рослин. 

2. Методи  отримання безвірусного посадкового матеріалу

1. Збудники  вірусних інфекцій рослин

     Основне джерело вірусу для більшої частини  рослин, які розмножуються вегетативно, – це хронічна інфекція в самій рослині. Відносно таких культур одним з найбільш успішних методів захисту від вірусних хвороб є вирощування безвірусних клонів (точніше клонів, що не містять якого-небудь певного вірусу). При цьому слід розв'язати дві проблеми. По-перше, вимагається знайти вільну від вірусу лінію потрібного сорту, а якщо сорт заражений цілком, то провести певну роботу, з тим щоб звільнити від вірусу яку-небудь рослину або частину рослини. По-друге, отримавши безвірусний клон, необхідно підтримувати якусь частину матеріалу у вільному від вірусу стані, а інший матеріал розмножувати в таких умовах, в яких повторне зараження цим вірусом зводиться до мінімуму або взагалі не має місця. Розмножений у такий спосіб посадковий матеріал використовують потім для вирощування культури на основних площах.

     Візуальне виявлення вірусного захворювання за симптомами не є позитивним методом  при селекції початкових рослин. Потрібні більш надійні методи ідентифікації  здорових і заражених рослин. Який з них слід застосувати в кожному  окремому випадку, це залежить від вірусу і від рослини-господаря. Ідентифікація багатьох вірусів (особливо тих, які уражають деревні породи) – дуже трудомістка справа. Основним методом є в цьому випадку щеплення однієї або декількох індикаторних рослин. Розподіл вірусу по дереву, особливо на ранніх стадіях інфекції, може бути нерівномірним; тому, для того, щоб переконатися у відсутності вірусу, необхідно повторювати ці тести протягом декількох років. Так, Хамптон, що прищеплював по чотири бруньки з досліджуваної рослини на кожне індикаторне дерево, виявив, що протягом першого року вірус карликовості сливи на рослинах вишні визначався не завжди (29 – 63 %, залежно від сорту). Вірогідність виявлення інфекції значною мірою зростала у тому випадку, коли дерево було заражене вже протягом трьох років. Нерівномірний розподіл вірусу може мати місце і у трав'янистих рослин. Бімстер, виявив, що при зараженні картоплі Y-вірусом інфікуються не всі бульби і навіть не обов'язково всі частини однієї і тієї ж бульби. Нижня частина бульби буває заражена рідше, ніж верхівка. Таким чином, верхівка бульби є надійнішим матеріалом для тестування.

     Для ідентифікації багатьох вірусів  можна використовувати метод  механічної інокуляції індикаторних рослин. Використовується і серологічний аналіз, а також різні цитологічні, електронно-мікроскопічні  та хімічні тести. Проте найбільш надійним методом виявлення здорових рослин залишається все ж постановка тестів на інфекційність.

     На  сучасному рівні знань можна  розділити віруси рослин на п'ять  великих груп на підставі відмінностей в структурі їх часток. Найбільш численними і краще всього дослідженими є палочкоподібні часточки і часточки, що характеризуються ікосаедричною симетрією. Вірус мозаїки люцерни виділений в самостійну групу, оскільки він є багатокомпонентним вірусом, що включає як ікосаедричні, так і палочкоподібні часточки. Хоча віруси раневих пухлин і карликовості рису, ймовірно, мають білкові оболонки, що мають ікосаедричну симетрію, вони нині є єдиними представниками вірусів рослин, дволанцюгових, які містять, РНК, і тому розглядаються як самостійна група. Нарешті, є група великих вірусів із зовнішніми оболонками, мембранами, що оточують центральний внутрішній компонент. Жоден з таких вірусів точно не охарактеризовані з хімічної точки зору. Майже всі відомості про цю групу отримані за допомогою електронної мікроскопії.

   Схематичні  зображення вірусів на рис. 3 приведені для того, щоб показати, наскільки різноманітні форми і розміри, характерні для вірусів рослин. 
 

Рис. 3 Схема, що ілюструє різноманітність розмірів і форми вірусів рослин

а –  вірус-сателіт; б – вірус жовтої мозаїки турнепса; в – вірус раневих пухлин;   г – вірус бронзовості томатів; д – вірус жовтяниці цукрового буряка; е – п’ять часток вірусу мозаїки люцерни; ж – дві частини вірусу тютюну; з – вірус тютюнової мозаїки; і – Х-вірус картоплі; к – вірус некротичного пожовтіння салату-латуку. 

         Препарати багатьох вірусів містять різні неповні  або дефектні вірусоподібні часточки. Нуклеїнова кислота майже всіх вірусів, що зустрічаються в природі, захищена білковою оболонкою. Проте відомі мутанти, отримані в лабораторних умовах, які мають дефектну оболонку, а також два віруси, що викликають веретеновидність бульб картоплі та захворювання кори цитрусових, таких, які мають багато властивостей, характерних для голої дволанцюжкової молекули РНК.

         Виділено і охарактеризовано багато палочкоподібних вірусів. Усі вони характеризуються досить високим відношенням білку до нуклеїнової кислоти, що відповідає їх структурним особливостям. Білкові субодиниці найбільш добре дослідженого представника цієї групи – ВТМ – розташовані у вигляді спіралі. Всі інші палочкоподібні віруси мають ту ж структуру. Існує два типи палочкоподібні вірусів. Одні з них, подібно до ВТМ і вірусу тютюну, є жорсткі палички завдовжки близько 300 нм або менше.