Генная инженерия

    Кроме того, недостаточно хорошо изучены  особенности перорального или интраназального применения ДНК-вакцин. Между тем, слизистые оболочки являются воротами инфекции для многих возбудителей заболеваний и известно, что для ряда патогенных микроорганизмов наиболее эффективным методом иммунизации является инициация иммунного ответа в месте инфицирования.

3.2.6. Вопросы безопасности  применения

    Существуют  опасения, что молекула ДНК-плазмиды может встраиваться в ДНК хромосом человека, что приведет к мутации  гена на этом участке. Однако эксперименты на мышах свидетельствуют, что интеграция плазмиды в ДНК мышей наблюдается приблизительно в 1000 раз реже, чем спонтанные мутации генов.

    Известно  также, что иммунологическая толерантность (неспособность к иммунному ответу на антиген) может быть вызвана повторным  введением очень низких доз антигена. При иммунизации посредством ДНК иммуногенный протеин также синтезируется в организме в небольшом количестве в течение продолжительного времени. Эта проблема требует более тщательного изучения, но, по-видимому, не является существенным препятствием в связи с возможностью регулирования количества вводимой ДНК и соответственно числа клеток, синтезирующих антигенный белок.

    Высказывалось предположение, что введение ДНК-вакцин может приводить к развитию аутоиммунных заболеваний в результате иммунной реакции, направленной против клеток организма человека, экспрессирующих антигенный протеин, или вследствие образования антител к чужеродной ДНК. Однако проведенные эксперименты позволяют надеяться, что введение ДНК-вакцин не повышает риск развития аутоиммунных реакций, во всяком случае по сравнению с применяемыми в настоящее время аттенуированными вирусными вакцинами.

3.2.7. Участие фармацевтических  компаний в разработке  ДНК-вакцин

    Осознание перспективности применения генных вакцин способствовало значительному увеличению финансирования исследований в этом направлении не только со стороны государственных организаций, но и частных компаний.

    Кроме быстро развивающихся биотехнологических компаний («Genentech», «Powderject», «Quiagen», «Cobequid», «Vaxin», «Vical Inc.»), к разработке ДНК-вакцин проявляют большой интерес и крупнейшие транснациональные фармацевтические компании («Aventis», «Glaxo Wellcome», «Merck», «Pfizer» и др.), которые проводят не только самостоятельные исследования в этой области, но и заключают соглашения с биотехнологическими компаниями или с академическими институтами о совместной разработке генных вакцин. Характерным примером может служить небольшая американская биотехнологическая фирма «Vical Inc.», которая одной из первых приступила к разработке ДНК-вакцин. Побудительным фактом для работы в этом направлении послужили результаты одного эксперимента, проведенного в лаборатории «Vical Inc.» в 1989 г., когда исследователи случайно установили, что введение «голой» вирусной ДНК мышам приводит к продукции большого количества вирусных белков. После этого фирма запатентовала метод прямого введения «голой» ДНК в клетки. Уже в 1991 г. «Vical Inc.» заключила соглашение с компанией «Merck & Co.» о совместной разработке ДНК-вакцин для предупреждения инфекционных заболеваний. Через 2 года в журнале «Science» были опубликованы результаты этих совместных исследований, подтверждающие эффективность применения ДНК-вакцины против гриппа у мышей. Вскоре компания «Merck & Co.» заключила ряд других соглашений с «Vical Inc.» относительно совместной разработки, производства или продажи терапевтических и/или профилактических ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИДа, туберкулеза, гепатита В, гепатита С, герпеса и заболеваний, вызываемых вирусами папилломы человека. Аналогичные соглашения фирма «Vical Inc.» заключила с другим крупнейшим производителем вакцин — компанией «Aventis Pasteur» — о разработке ДНК-вакцин, предупреждающих инфицирование цитомегаловирусом, возбудителем малярии, H. pylori, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом ветряной оспы и др. «Vical Inc.» сотрудничает также с компанией «Aventis Pharma» (ранее «Rhone Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Inc.»), «Pfizer Inc.» (разработка ДНК-вакцин для применения в ветеринарии) и др. Компания «Vical Inc.» проводит также клинические исследования (I или II фаза) терапевтических вакцин и методов генной терапии (на основе технологии «голой» ДНК) для лечения больных с некоторыми злокачественными новообразованиями.

    Аналогичным образом развивается сотрудничество компаний «Glaxo Wellcome» и компании «Powderject» в области разработки ряда профилактических и терапевтических ДНК-вакцин.

    ДНК-вакцины  обладают большим потенциалом и  могут вызвать революцию в  вакцинологии. Однако многие специалисты  не спешат делать окончательные выводы до тех пор, пока не получат достаточное количество данных клинических исследований, убедительно свидетельствующих об эффективности и безопасности ДНК-вакцин. В ближайшие несколько лет не следует ожидать их внедрения в медицинскую практику, поскольку большинство из разрабатываемых вакцин находится на этапе доклинических или проходят I–II фазу клинических исследований

3.3. Генотерапия

    Технологии  генодиагностики и генотерапии  базируются на мировых достижениях  в расшифровке генома человека. Технологии генодиагностики включают разработку приемов точной локализации генов в геноме человека, ответственных за наследственные и соматические заболевания, а также методологии пренатальной и доклинической диагностики. Их важной составляющей является сравнительный анализ структуры генома в норме и патологии.

    Среди технологий генотерапии в настоящее  время актуальны следующие: генотерапия  соматических клеток, генотерапия репродуктивных (половых) клеток, генотерапия с использованием рибозимов и антисенс-ДНК.

    Генотерапия и генодиагностика - это перспективные технологии фундаментальной и прикладной биомедицины, направленные на лечение и профилактику наследственных (генетических) и приобретенных заболеваний, в том числе онкологических.

    В основе генотерапии, развивающейся  на базе и в комплексе с генодиагностикой, лежит контролируемое изменение генетического материала клеток, приводящее к "исправлению" не только наследственных, но и, как стало ясно в последнее время, приобретенных генетических дефектов живого организма.

    Важнейшей технологической задачей генотерапии является разработка системы переноса или адресной доставки корректирующего генетического материала к клеткам-мишеням в организме больного, несущего в своем геноме дефектный ген. Предлагаемые технологии характеризуются точностью выявления гена, ответственного за генетический дефект и выбора системы переноса корректирующих генов, адресностью доставки в организм больного генетического материала, исправляющего генетический дефект.

    Технологии  генодиагностики и генотерапии  применяются в следующих отраслях:

    здравоохранение (развитие методологии генодиагностики  и, в частности, системы пренатальной генодиагностики, будет способствовать своевременному выявлению генетических болезней и принятию соответствующих  профилактических мер; генотерапия может быть использована для лечения болезней, связанных с мутациями генома (в том числе серповидно-клеточной анемии, эмфиземы, гемофилии и др.), инфекционных заболеваний; для коррекции дефектов центральной нервной системы и для стимуляции иммунного ответа организма при онкозаболеваниях);

    сельское  хозяйство (технологии генодиагностики  и генотерапии могут быть применены  в ветеринарии и фитопатологии).

    Технологии  генодиагностики и генотерапии  являются инструментом реализации новой  медико-биологической стратегии, конечная цель которой - избавление человечества от генетических и приобретенных болезней. Актуальность генотерапии для человека связана с тем, что более 5000 наследственных и приобретенных заболеваний связано с генетическими дефектами. Генотерапия может использоваться не только для лечения, но и для профилактики наследственных и приобретенных заболеваний. Таким образом, данная технология имеет большое социальное и народнохозяйственное значение.

    За  рубежом генодиагностика и генотерапия  рассматриваются как один из приоритетов развития биомедицины. К настоящему времени одобрено более 7 протоколов по генотерапии, в которых предложены способы лечения наследственных заболеваний. Такие протоколы разрабатываются в Китае, Франции, Великобритании, Италии, Нидерландах и ряде других стран. В США Национальным Комитетом по рекомбинантным ДНК (RAC) одобрено 18 клинических испытаний с использованием генотерапии, начато лечение одного из видов рака кожи - меланомы. 
В Российской Федерации также освоены основные технологии генотерапии - секвенирование, физическое и генетическое картирование генома человека и животных, осуществляется расшифровка молекулярных механизмов наследственных и онкозаболеваний, решаются проблемы генетической безопасности человека, сохранения его генофонда в условиях разрушающего антропогенного воздействия среды. Вместе с тем, для достижения зарубежного уровня в этой области России необходимо принять срочные меры по увеличению финансирования НИОКР и по усилению приборного обеспечения. Необходимым условием развития предлагаемых технологий в стране является организация международной кооперации.

    Генную  терапию на современном этапе  можно определить как лечение  наследственных, мультифакториальных  и наследственных (инфекционных) заболеваний. Путем введения в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генетической терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухаль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генетической терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезоминазы (АДА). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) 4-летней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1:100000), были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные в не организма (ex vivo) геном АДА (ген АДА + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдается в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев. За 3 года терапии проведены 23 внутривенные инъекции. В результате лечения, состояния пациентки настолько улучшилось , что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Сейчас эти испытания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.

3.3.1. Методы генетической  трансфекции в  генной терапии.

    Решающим  условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с использованием чистой (голой) ДНК, встроенной соответствующей плазмиду, или комплексированной ДНК (плазменная ДНК, соединенная с солями, белками, органическими полимерами), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных к репликации.

    Основные  методы доставки чужеродных генов в  клетке разделяются на химические, физические и биологические. Эффективность  трансдукцированной чужеродной ДНК  при различных способах трансфекции  в ДНК клетки-мишени (приведены в таблице 3). Только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности, способны  к активной трансдукции, а в некоторых случаях и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генной терапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.

    Таблица 3.

    Основные  характеристики генетической трансфекции  in vitro

    Обзор данных (табл. 3.) позволяет прийти к  заключению, что несмотря на усилия многих лабораторий мира все усилия известные и испытанные in vitro и in vivo векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных in vitro успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильности интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждается в серьезных доработках.

    Прежде  всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов (таблица 3). Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рцептор-опосредованных систем (рис 4.), либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть, ДНК – структур, способных к длительной персистенции внутри ядер). В последнее время особое время уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом, такие мини хромосомы длительно удерживаются в клетке и способны нести полноразмерные гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена в нужной ткани и в должное время.