Біотехнологія ферментів

     Адсорбційна іммобілізація є найбільш старим з існуючих способів іммобілізації ферментів, початок їй було покладено ще в 1916 р. Цей спосіб досить простий і досягається при контакті водного розчину ферменту з носієм. Після відмивання неадсорбованого білка іммобілізований фермент готовий до використання. Утримання адсорбованої молекули ферменту на поверхні носія може забезпечуватися за рахунок неспецифічних ван-дер-ваальсових взаємодій, водневих зв'язків, електростатичних і гідрофобних взаємодій між носієм і поверхневими групами білка. Вклад кожного з типів зв'язування залежить від хімічної природи носія і функціональних груп на поверхні молекули ферменту. Взаємодії з носієм можуть виявитися настільки сильними, що сорбція біокаталізатора може супроводжуватися руйнуванням його структури. Наприклад, при адсорбції деяких рослинних клітин на гранулах цитодекса клітинна стінка деформується, повторюючи рельєф поверхні частинок носія. Перевагою методу адсорбційної іммобілізації є доступність і дешевизна сорбентів, які виступають в ролі носіїв. Їм також можна надати будь-яку конфігурацію і забезпечити необхідну пористість. Важливий фактор – простота застосовуваних методик. При адсорбційному зв'язуванні можна вирішити і проблему очищення ферменту, так як зв'язування білка з носієм в багатьох випадках досить специфічне. На жаль, міцність зв'язування ферменту з носієм не завжди достатньо висока, що обмежує застосування методу. До недоліків адсорбційної іммобілізації слід віднести відсутність загальних рекомендацій, що дозволяють зробити правильний вибір носія та оптимальних умов іммобілізації конкретного ферменту.

     Деякі з перерахованих труднощів можна  уникнути при іммобілізації ферментів  шляхом включення в гелі. Суть цього  методу іммобілізації полягає в  тому, що молекули ферменту включаються  в тривимірну сітку з тісно  переплетених полімерних ланцюгів, що утворюють гель. Середня відстань між сусідніми ланцюгами в  гелі менше розміру молекули включеного ферменту, тому він не може покинути полімерну матрицю і вийти  в навколишній розчин, тобто знаходиться  в іммобілізованому стані. Додатковий внесок в утримування ферменту в  сітці гелю можуть вносити також  іонні та водневі зв'язки між молекулою  ферменту та сусідніми полімерними  ланцюгами. Простір між полімерними  ланцюгами в гелі заповнено водою, на частку якої зазвичай припадає значна частина всього обсягу гелю. Наприклад, широко застосовуються гелі полімерів акрилової кислоти в залежності від концентрації полімеру і його природи містять від 50 до 90% води.

     Для іммобілізації ферментів у гелі існує два основних способи. При одному з них фермент поміщають у водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, в результаті чого утворюється полімерний гель з включеними в нього молекулами фермента. В реакційну суміш часто додають також біфункціональні (що містять у молекулі два подвійних зв’язки) зшиваючі агенти, які надают утвореному полімеру структуру тривимірної сітки. У другом випадку фермент вносять в розчин готового полімеру, яким потім будь-яким пособом переводять у гелеподібний стан. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення у полімерний гель дозволяє створювати препарати будь-якої геометричної конфігурації, забезпечуючи при цьому рівномірний розподіл біокаталізатора в об’ємі носія. Метод універсальний, застосовується для іммобілізації практично будь-яких ферментів, поліферментних систем, клітинних фрагментів і клітин. Фермент, що входить у гель, стабільний, надійно захищений від інактивації внаслідок бактеріального зараження, так як великі клітини бактерій не можуть проникнути у дрібнопористу полімерну матрицю. У той же час, ця матриця може створювати значні перешкоди для дифузії субстрату до ферменту, знижуючи каталітичну ефективність іммобілізованого препарату, тому для високомолекулярних субстратів даний метод іммобілізації практично не застосовується.

     Загальний принцип іммобілізації ферментів з використанням мембран полягає в тому, що водний розчин ферменту відділяється від водного розчину субстрату напівпроникною перегородкою. Напівпроникна мембрана легко пропускає невеликі молекули субстрату, але нездоланна для великих молекул ферменту. Існуючі модифікації цього методу розрізняються лише способами отримання напівпроникної мембрани та її природи. Водний розчин ферменту можна включати всередину мікрокапсул, що представляють собою замкнуті сферичні пухирці з тонкої полімерної стінкою (мікрокапсулювання). При подвійному емульгуванні виходить водна емульсія з крапель органічного розчину полімеру, що містять, в свою чергу, ще більш дрібні краплі водного розчину ферменту. Через деякий час розчинник твердіє, утворюючи сферичні полімерні частинки з іммобілізованим в них ферментом. Якщо замість водонерозчинного твердіючого полімеру використовуються рідкі вуглеводні з високою молекулярною масою, метод називається іммобілізацією шляхом включення в рідкі мембрани. До модифікацій методу іммобілізації ферментів з використанням напівпроникних оболонок відносяться також включення до волокна (при цьому замість крапель, що містять ферменти, виходять нитки) і включення в ліпосоми. Застосування систем мембранного типу дозволяє отримувати іммобілізовані препарати з високим вмістом ферменту. Цей метод, як і попередній, досить універсальний, тобто застосовується як до ферментів, так і до клітин, а також їх фрагментів. Завдяки високому відношенню поверхні до обсягу і малої товщині мембрани вдається уникнути значних дифузійних обмежень швидкості ферментативних реакцій. Основний недолік мембранних систем – неможливість ферментативного перетворення високомолекулярних субстратів.

     При іммобілізації ферментів з використанням систем двофазного типу обмеження вільного переміщення ферменту в обсязі системи досягається завдяки його здатності розчинятися тільки в одній із фаз. Субстрат і продукт ферментативного перетворення розподіляються між обома фазами відповідно до їх розчинності в цих фазах. Природа фаз підбирається таким чином, що продукт накопичується в тій із них, де фермент відсутній. Після завершення реакції цю фазу відокремлюють і беруть із неї продукт, а фазу, яка містить фермент, знову використовують для проведення чергового процесу. Одним з найважливіших переваг систем двофазного типу є те, що вони дозволяють здійснювати ферментативні перетворення макромолекулярних субстратів, які неможливі при застосуванні жорстких носіїв з обмеженим розміром пор.

     Головною  відмітною ознакою хімічних методів  іммобілізації є те, що шляхом хімічної взаємодії на структуру ферменту в його молекулі створюються нові ковалентні зв'язки, зокрема між  білком і носієм. Препарати іммобілізованих  ферментів, отримані із застосуванням  хімічних методів, мають принаймні  двома важливими достоїнствами. По-перше, ковалентний зв'язок ферменту з носієм забезпечує високу міцність утворення кон'югату. При широкому варіюванні таких умов, як рН і температура, фермент не десорбується з носія і не забруднює цільові продукти, які каталізують реакції. Це особливо важливо при реалізації процесів медичного та харчового призначення, а також для забезпечення стійких, відтворюваних результатів в аналітичних системах. По-друге, хімічна модифікація ферментів здатна приводити до істотних змін їх властивостей, таких як субстратна специфічність, каталітична активність і стабільність. Хімічна іммобілізація ферментів є мистецтвом, рівень якого визначається, в першу чергу, умінням експериментатора. Основне завдання експериментатора полягає у формуванні нових ковалентних зв'язків у молекулі ферменту при використанні його функціональних груп, несуттєвих для прояву його каталітичної активності. При хімічній модифікації ферменту його активний центр бажано захищати. При зіставленні різних прийомів іммобілізації, хімічні методи для великомасштабних біотехнологічних процесів здаються малопривабливими через складність і дорожнечу.  
 
 
 
 
 
 

     ВИСНОВКИ 
 

     Мікроорганізми більш кращі як джерело ферментів в порівнянні з рослинами або тваринами з наступних причин:

     1) вони мають більш високі швидкості росту;

     2) їх можна отримати у великих кількостях в ферментерах в контрольованих умовах, що економічно вигідно;

     3) вони здійснюють широкий спектр хімічних реакцій;

     4) їх властивості можна легко поліпшити за допомогою методів генної інженерії або шляхом отримання різноманітних мутантів;

     5) у них дуже прості потреби в поживних речовинах;

     6) вони здатні рости на дуже дешевих субстратах, часто на відходах;

     7) швидкість продукції можна змінювати залежно від потреб;

     8) вони продукують безліч позаклітинних ферментів, які легко збирати і очищати.

     Якщо фермент виділяють з мікроорганізму, то цей мікроорганізм спочатку нарощують у великій кількості у ферментері. Глюкозу намагаються не використовувати як джерело живлення, тому що вона пригнічує синтез багатьох корисних ферментів. Зазвичай використовують періодичну ферментацію, за винятком виробництва глюкозоізомерази з Bacillus coagulans, яке являє собою безперервний процес. Багато ферментів самі виділяються з клітін, будучи, таким чином, позаклітинними ферментами. Ферменти можна використовувати в тому вигляді, в якому вони отримані.

     СПИСОК  ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

     1. Безбородов А.М. Ферменты микроорганизмов и их применение // Биотехнология. М.: Наука, 1984. 157 С.

     2. Березин И. В. Иммобилизованные ферменты Т. 7 // Биотехнология. М.: Высшая школа, 1987. 187 С.

     3. Быков В.А. Производство белковых веществ. М.: Высшая школа, 1987. 142 с.

     4. Вудворт Дж.  Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы //. М.: Мир, 1988. 215 с.

     5. Клесов А.А. Применение иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности // Биотехнология. М.: Наука, 1984. 116 С.

     6. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты // Биотехнология. М.: Наука, 1984. 105 С.

     7. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир, 1983. 213 с. 27.