Ағзаларды клондау

“Астана Медицина Университеті” АҚ

Кафедра:___________________________________________________

 

 

 

 

 

 

 

Тақырыбы: Ағзаларды клондау

 

Орындаған:  Бариева Г.Ж.

                                                                                                       Топ: 101 ҚДС

                                                                                                                           Тексерген : Сманова Г.Б.

 

 

 

 

 

 

Астана, 2012 ж.

Жоспары:

 

 

• 1.  Кіріспе
• 2.  Клондау
• 3.  Ген клонын  көбейту және  скрининг
• 4.  Эукариот клеткасында  ген  клонын  көбейту
• 5.  Клондау тәсілі
• 6.  Пайдаланған әдебиеттер  тізімі

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кіріспе

Көбеюге қабілеттілік – тірі организмдерге  тән негізгі қасиеттердің бірі. Көбеюге  байланысты генетикалық материалдың  ата-аналарынан ұрпақтарына берілетіні айтылды. Бұл кезде сол түр  особьтарына тән белгілер ғана емес, сондай–ақ тек ата-аналарының өздеріне тән айқын белгілер де жарыққа шығады. Көбеюдің үлкен биологиялық мәні бар. Ол белгілі бір организм түрінің ұрпақ алмастыруын жүзеге асыруымен қатар, ұрпақтар арасындағы сабақтастықты, жалпы тіршіліктің үздіксіздігін қамтамасыз етеді. Тірі табиғатта көбеюдің негізгі екі әдісін ажыратады: жынысты және жыныссыз.

Жыныссыз  көбею.  Жыныссыз көбею кезінде ұрпақ тек бір особьтың бір немесе бірнеше соматикалық клеткаларынан дамып жетіледі. Мұның нәтижесінде бір-біріне айна-қатесіз ұқсас, біркелкі особьтар түзіледі. Оларды клон  деп атайды. Кездейсоқ мутациялардың әсерінен бір клондағы особьтар әр-түрлі генетикалық өзгерістерге ұшырауы мүмкін. Мұндай өзгерістердің бірнеше ұрпақ бойы тұқым қуалауы түрдің өзгергіштігіне және эволюцияға сәйкес болады.

Жыныссыз көбею табиғатта кең  таралған құбылыс. Мұның бірнеше  формалары бар:

• Жай бөліну
• Көптік бөліну немесе шизогония
• Спора түзу
• Бүршіктену
• Фрагментация

      Ал жынысты көбею дегеніміз – аналық жұмыртқа клеткасы мен аталық сперматозоидтың қосылуынан болатын көбею түрі.Соның нәтижесінде зигота пайда болады.

 

 

 

Клондау(грек. clon – ұрпақ, бұтақ) - жасанды ортада өсіру арқылы рекомбинантты ДНҚ молекуласын анықтау әдісі. Келесі анықтама бойынша «Клондау – жеке клетканың немесе организмнің генетикалық біртипті көшірмесін жасау процесі. Сонымен қатар бұл организмдер тек қана сыртқы көрінісімен ғана емес, генетикалық код бойынша да бірдей. Клондау – тірі объектінің бірнеше көшірмесін дәл жаңадан өндіру болып табылады. Клондаудың мүмкіндіктері өсімдіктанушыларға, жануартанушыларға және медициналық қолдану жағынан көптеген жаңа перспективалар ашып жатыр. 20 ғ-дың 60-жылдарының басында кейбір жоғары сатыдағы өсімдіктер мен жануарларды Клондау әдістері жете зерттелді. Бұл әдістерге даму сатысын аяқтап, толық жетілген клеткалар ядросында организмнің барлық белгілері болатыны туралы ақпарат анықталғаннан кейін қол жеткізілді. Клондау кезінде клеткадағы белгілі гендер жоғалмайды (тек Клондау процесіне қосылмаған гендер ғана жойылып отырады). Клондау туралы алғашқы мағлұматты Корнелль универстетінің (АҚШ) профессорлары жүргізген тәжірибелерден көруге болады. Олар өсуге қажетті қоректік заттар мен гормондары бар ортада сәбіз тамырының жеке клеткаларын өсіру арқылы, осы өсімдіктің жаңа формасын алды. Кейінірек Ұлыбританияның Оксфорд университетінің ғалымы Д.Гердон (1933 ж. т.) алғаш рет жануар омыртқасын Клондауға болатынына қол жеткізді. Ол өзінің ядросы алдын ала ультракүлгін сәулелері арқылы жойылған құрбақаның жұмыртқаклеткасына, ішек клеткаларынан алынған ядроны егу (қондыру) арқылы әуелі итбалықты, соңынан сол ядро алған құрбақаға ұқсас дарабасты алды. Бұл тәжірибелер тек дифференциалданған (арнайы) клеткаларда организмнің дамуына қажетті барлық ақпараттардың болатынын дәлелдеп қана қоймай, сондай-ақ, жоғары сатыдағы организмдерді, соның ішінде адамды да, Клондауға болатынын көрсетті. Клондау арқылы өте пайдалы өсімдік сорттарын алуға және мал тұқымын асылдандыруға болады. Бірақ Клондаудың мұндай әдістері (өсімдік сорттары мен асыл тұқымды мал алатын) адамдарға қолдануға келмейді. Теориялық түрде әйелдің де, еркектің де генетикалық көшірмелерін жасауға болады. Бірақ клондалатын клетка даму сатысының барлық кезеңдерінен өтуі керек, міне, сол кезде клеткаға сыртқы ортаның қалай әсер ететіні әлі толық анықталған жоқ.

Энуклеирленген аналық клеткаларға  эмбриондық клеткалардың ядроларын  көшіру жолымен эмбриондарды клондау: Эмбриондық клеткалардың ядроларын энуклеирленген аналық клеткаларға көшіргеннен кейін ядро қайта бағдарланады да, жаңа эмбрион дами бастайды. Теориялық түрде донордың эмбрионынан барлық бластомерлері бір генетикалық негізде және бірдей тұқымдардың дамуын қамтамасыз етуге қабілетті болады. Ядроларды көшіргеннен кейін дамыған эмбриондар өз кезегінде ядролардың донорлары ретінде пайдалануы мүмкін. Бірнеше генерациялардан кейін жүздеген және мыңдаған бірдей эмбриондарды алуға мүмкіндік туады.

 

Ген клонын көбейту  және скрининг

Қазіргі кезде ген инженериясының практикасында ген клонын көбейтудің  екі әдісі кең қолдану алды: геномның жеке  фрагментін (кДНҚ-ны  қажет геннің иРНҚ молекуласынан кері  транскриптаза ферменті көмегімен алу) және барлық геном клонын көбейту.

Комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) клонын көбейту  әдісін организмнің қайсы клеткаларында  қажет белок синтезінің білгенде ғана қолдануға болады. Оның үстіне белоктың  синтезделуі анағұрлым  көп мөлшерде өтуі керек,  тек  сонда ғана клеткада қажет белоктың иРНҚ-сының көшірмелері көп болады және  геннің көшірмелері бар деп есептелінеді.

Ген скринингісінің келесі жауапты  кезеңі фильтерді  радиоактивті  зондпен өңдеу. Зонд (сүңгі) дегеніміз -  іздеп жатқан  ген бөлігінің азоттық негіздеріне  комплементарлы кішігірм  ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Зонд әр уақытта  радиоактивті  изотоппен белгіленеді. Зондты синтездеу үшін  геннің немесе  белоктың ең болмағанда  кішігірім бөлігінің  нуклеотидтер  тізбегі белгілі болуы керек.  Олардың амин  қышқылдар тізбегі бойынша  және  генетикалық кодтың көмегімен геннің  бөлігін  коделейтін  нуклеотидтер  тізбегін оңай алуға болады. Табиғи зонд ретінде қажет геннің  функциясы жоғары  өтетіні  белгілі  клеткадан белгілі  клеткадан әр түрлі  жолдар арқылы  алынған РНҚ-ны  пайдалануға болады.  Көпшілік жағдайда  осындай РНҚ-дан  кері  транскрипция процесі  арқылы алынған олигонуклеотидтік ДНҚ зонд ретінде  жиі қолдану алды.

 

Эукариот клеткасында ген клонын көбейту

Эукариоттар ген инженериясында  қарапайын эукариот -  ашытқының елеулі маңызы бар.  Ашытқылар бір клеткалы болғанымен оларда эукариоттарды  сипаттайтын барлық қасиеттер бар.

Ашытқылар ішінен Saccharomyce  cerevisiae  штамы кең қолдану алады. Рекомбинантты  молекулалар құрастыру үшін  бұл штамның ұзындығы 2мкм (6300 н.ж.) тең SepI  плазмдасы жиі қолданылады.  Осы плазмиданың Е.СоІі  бактериясының гибриді қолданылады. Мұндай ген тасығыштар  өтпелі векторлар деп аталады, өйткені олар  эукариоттық клеткада да,  прокариоттық клеткада да  репликациялана алады.  Мұндағы бактериялық плазмиданың бөлігі векторды таңбалау үшін маңызы зор.  Осындай векторлардың көмегімен бактериялық клеткада құрастырылған рДНҚ-ны  эукариоттық - ашытқы  клеткасына тасмалдауға болады және керісінше.  Қазіргі кезде ішімдік өндіру  үшін қажет химозинді,  адамның интерфероны  мен инсулины және т.б. қажет белоктарды синтездейтін  ашытқылар алынады.

 

Клондаудың тәсілдері.

Аталып өткендей , клондау деп  жыныссыз көбею арқылы біртипті ұрпақ  алуды айтамыз. Неміс эмбриологы Г.Дриш ең алғашқы болып жасанды жолмен егіздерді алуға болатынын дәлелдеді. Теңіз кірпісінің клеткасын екіге бөліп, екі біртипті ағза алды.

                         

ХІХ ғасырдың аяғында Г.Дриш түрліше  тәжірибелер жасап (бөлшектенуші ұрықтың эктодерма және мезодерма жасушаларының ядроларын өзара алмастырғанда қалыпты дамудың бұзылмайтындығын) дәлелдеген. Яғни ұрықтың бөлшектенуі және одан кейінгі жіктелуі кейбір гендердің жойылуына не ядро материалдарының кері қайтпайтынын өзгерістеріне алып келмейді. Ұрық жасушасы ядросының мұндай күйін тотипотенттілік  деп атайды. Ұрық жасушалары өздерінің дамуында алғаш тоттипотентті, содан кейін детерминацияланған, сосын жіктелген күйде болады.

Дене жасушаларының тотипотенттілігі – дегеніміз олардың кез-келгенінің ағзаның толық дамуын қамтамасыз ету қасиеті болып табылады.

Ол өсімдіктерге және жануарларға  тән. Мал шаруашылық тәжірибеде «құрастырылған» жануарларды алу технологиясының екі түрі бар – түрдің ішінде және түрлердің арасында. Түрдің ішінде «құрастырғанда» клондалған, түрлердің арасында «құрастырғанда» - химералық жануарлар алынады.

Клондалған жануарларды алу  екі әдісін айырады:

1. Имплантацияға дайындалған ұрықтың дисекция әдісі. Осындай әдіспен алған жануарларды монозиготтық егіздер деп атайды.
2. Энуклеарды жұмыртқа жасұшаларына сома жасұшаларынан алынған ядроны отырту.

Дисекция әдісі. Монозиготты жануарлар алу негізінде тотипотенттік (әр бір бластомераның ұрықтан бөлінгенде өмір сүре алатын тұқым беру қасиеті) жатыр, ал осындай әдіспен клондарды алу негізінде жануарлардың биологиялық ерекшеліктері жатыр – бір жұмыртқалы егіздерді табу.

Монозиготты жануарларды  алу әдістемесі келесі процедуралардан  тұрады.

1. Ұрғашы-донордың жыныс жолдарынан 2-8 бластомералық бөліну кезеңіндегі ұрықтарды алу.
2. Пеллюцид зонасын алу. Алу екі әдісін айырады: 1) микроманипулярлы құралдың астында механикалық бөлу; 2) фермент проназаның көмегімен ферментативтық әсер ету.
3. Ұрықты бөлек бластомераларға бөлу.
4. Бөлініп алынған бластомераларды энуклеардық жұмыртқа жасұшасына инъециялау.
5. Құрастырылған ұрықты агар цилиндіріне кіргізу. Агар ұрғашының жыныс жолында ерімейді, ұрыққа дамуға жағдайлар тұылады.
6. In vivo культивирлеу. Ұрықты агармен бірге реципиенттің жұмыртқа жолына кіргізеді. Реконструкциядан өткен ұрықтарды культивирлеу үшін реципиент ретінде қойлармен қолданады. Ұрықтарды бластоциста кезеңінедейін культивирлейді. Кейіннен лапаротомия әдісімен бластоцистаны жұмыртқа жолынан алып, агарды алып тастап, ұрықты бағалайды.
7. Биологиялық толық ұрықтарды ұрғашы-реципиенттің ипсилатералдық мүйізшесіне еңгізеді.

Энуклеация әдісі. Әдіс келесі процедуралардан тұрады:

1. Овуляциядан өткен жұмыртқа жасұшаны донордың репродуктивтық жолынан алып дайындау.
2. Микроинемен ұрықтандырылмаған жұмыртқа жасұшаны полярлы дененің астында кесіп цитохалазин қосылған фосфаттық ортаға салады.
3. Пипеткамен полярлы денені және оның қасындағы цитоплазманы бір сағат культивирлеуден кейін сорып алады. Сонымен жұмыртқа жасұшасы екіге бөлінеді. Полярлы дененің бар жартысында метафаза ІІ кезеңіндегі хромосома бар (жұмыртқа жасұшаның «ядролық» жартысы). Екінші бөлекте ядролық құрылымдар жоқ («энуклеардық» жарты).
4. Жануарлардың сома жасұшаларынан бөліп алған ядроларды «энуклеардық» жұмыртқа жасұшасына салады.
5. Электроқосылудан кейін ұрықтың цитоплазмасымен ядроны фосфаттық буферге салады.
6. Ұрықтарды агарға салу (әдістемесі жоғарыда көрсетілген).
7. In vivo культивирлеу. Реципиенттің жұмыртқа жолдарына ұрықтар отырғызылып 4-6 күн инкубацияға жатады.
8. Ұрықтарды алып биологиялық толықтығын анықтау.
9. «Құрастырылған» ұрықты ақырғы реципиентке отырту.

 

Мұны алғашқылардың бірі болып  орыс ғалымы Г.В.Лопашов (1946) тритон жұмыртқа жасушасына дене жасушасының ядросын  қондырып (трансплантациялап) дәлелдеген. Дегенмен, ядро трансплантациясы әдісін толық және кең көлемде, табысты жүргізген ағылшын генетигі  Дж.Гердон болатын.

                      

1976 жылы Дж. Гердон клондаудың  мүмкін екенін бақаларға тәжірибе  жасау арқылы дәлелдеді. Бірақ  тек  1983 жылы ғалымдар  ересек бақалардың клондарын алды. Дж. Гердон 1962 жылы Xenopia laevis бақасының итбалығының ішек эпителиі  жасушасының ядросын ұрықтанбаған жұмыртқа жасушасына енгізген. Ол үшін алғаш жұмыртқа жасушасының ядросын ультракүлгін сәулесінің үлкен дозасымен сәулелеп жойған (өлтірген), содан кейін итбалық ішегінің эпителий жасушасының ядросын микропипетка арқылы сорып алып, (бұл кезде жасуша қабықшасы бұзылып ядро бөлініп шығады) оны ядросыз (ядросы өлтірілген) жұмыртқа жасушасына енгізген.        Содан кейін, жасанды жолмен пайда болған зиготаның дамуын инициациялаған. Нәтижесінде кейбір жұмыртқалар әрі қарай дамымай өліп қалған, екінші біреулері дамып, бөлшектеніп бластула сатысына жетіп, мутантты ұрық түзілген, ал 1% жұмыртқалар қалыпты дамып, алғаш итбалыққа, сосын  ересек бақаларға айналған.Дж. Гердон тәжірибелері   - қазіргі кезде қол жеткізген жоғары сатылы диплоидты ағзаларды  клондаудың алғашқы қарлығаштары болатын.