Методы управления онтогенезом (генная инженерия, биотехнология и направленное выращивание молодняка)

Увеличить эффективность  слияния удалось с помощью  японского гемаглютинирующего вируса. Позднее вместо этого вируса использовали вирус Сендай. Слияние возможно между  разными клетками одного организма и клетками разных отдаленных видов.

Факторы роста, необходимые для культивирования  некоторых клеток, следующие; инсулин, трансферин, этанола-мин. гидрокортизон, дексаметазон, простагландин, фосфо-этаноламин, пролактин, гипофизарный экстракт и  другие.

Но при слиянии  клеток разных видов животных всегда происходит элиминация хромосомы одного из них. Полученные гибридные клетки стали объектами для генетического  анализа. Применение химических веществ  типа полиэтилен-гликоля способствует слиянию клеток разных видов животных и даже растительных клеток с животными. Клетки, которые слились, сначала формируют одну большую клетку с двумя разными ядрами. И если в одном из ядер начинается синтез ДНК, то он стимулируется и в другом ядре. В целом оба ядра делятся одновременно, их хромосомы смешиваются и две полученные клетки имеют хромосомы обоих первоначальных видов. Они могут быть гибридами мыши и крысы, кошки и собаки, человека и мыши.

Используя клеточную  инженерию в животноводстве, можно  культивировать клетки сколько угодно времени, но, в отличие от растений, из них невозможно получить взрослый организм.

Возможность слияния  клеток животных явилась толчком  развития клеточной технологии в  области инфекционных заболеваний  для получения моноклинальных антител  с заданной специфичностью, гомогенных по молекулярным свойствам, которые применяются для диагностики, профилактики и лечения.

Одним из самых  перспективных методов иммунохимической диагностики вирусных, бактериальных  и других инфекций сельскохозяйственных животных является иммуноферментный тест.

В настоящее  время используется методика, с помощью  которой возможно слияние лимфоцита с раковой (миэломной) клеткой. Полученный гидрид быстро делится, образуя клон из миэломных клеток, которые синтезируют один вид антител, присущих исходному лимфоциту. Такой клон дает возможность получать сколько угодно антител против определенного вида белка (антигена).

Клонирование  — это способ выведения популяций, клетки которых получены из одной  первичной клетки. Оно позволяет  отселекционировать суперэффективную популяцию и стабилизировать  популяцию клетки с желательной  клеточной функцией. Таким образом получают вакцину к вирусу ящура путем моноклинальных антител к нему.

Самостоятельным направлением клеточной инженерии  является оплодотворение яйцеклеток в  пробирке на ранних стадиях развития. Этот метод (трансплантация эмбрионов) мы рассмотрели в предыдущей главе. 
Для изучения механизмов развития используют метод получения генетических мозаик (химер) путем слияния эмбрионов разных генотипов. У животных-химер часть клеток происходит от одной пары родителей, а другая часть— от другой пары. т.е. такие особи имеют четверых родственников. В природе примером химер является фримартинизм — бесплодие телок из разнояйцовых двойней у крупного рогатого скота. Такие животные являются универсальными донорами и реципиентами, т.е. между ними возможна трансплантация тканей и органов. Это обусловлено тем. что в период эмбриогенеза у них возникает явление иммунологической толерантности — очень перспективный путь для пересадки органов и тканей в медицине и ветеринарии.

Большое значение имеют межвидовые химеры, которые  впервые были получены от овцы и козы. Химерный эмбрион трансплантировали в матку самок. У потомства голова, рога, хвост и шерсть были от козы. Химерным был состав белков крови. Известны межвидовые и межпородные химеры у крупного рогатого скота (гибриды домашнего и зебувидного скота, симментальской и голштинской пород и другие). Химерные телята были получены при трансплантации 32-клеточных эмбрионов от коров контрастных пород— голштинской и швицкой бурой. Из семи родившихся — у пяти химеризм отсутствовал, а у двух— в фенотипе наблюдалось смешение мастей — черно-пестрой и бурой.

При спаривании химерных животных с нормальными  в большинстве случаев они  были стерильными. Подобно гетерозиготам  или гибридам в потомстве химерных особей происходит расщепление, при  котором нарушаются ценные генетические комбинации. Большой практический интерес имеет соединение в фенотипе животных на протяжении одного поколения (путем получения химер) признаков молочной и мясной продуктивности, которые являются антагонистами.

Этот метод  можно применять для восстановления клеточной массы эмбриона, поделенного на несколько частей, если использовать для этого клетки тератокарциномы. Клетки этой эмбриональной опухоли включаются в нормальное развитие, если их инъецируют в чужеродную бластоцисту. Тогда они клонируют практически все основные ткани и рождается химера, совершенно новый генотип.

Практическое  значение химерных животных заключается  в том, что у них есть резервы  для усиления хозяйственно-полезных признаков, продуктивности, устойчивости к заболеваниям.

С помощью слияния  эмбрионов с культурными или  дикими видами можно сберечь генофонд выдающегося животного, эмбрионы которого неспособны к самостоятельному развитию. Слияние эмбрионов местных пород  со специализированными влияет на акклиматизационные способности животных.

Существует возможность  создания линий (клонов ) животных путем партеногенеза (развития особи из яйцеклетки без участия сперматозоида) и трансплантации с биологически полноценными эмбрионами клеток ранних партеногенетических зародышей.[7,8]

2.3. Генная инженерия.

Генетическая  инженерия — это отрасль молекулярной биологии, в которой разрабатываются  методы передачи генетического материала  от одного живого организма к другому  с целью получения новой генетической информации и управления наследственностью. Ее развитие связано с достижениями генетики, микробиологии и биохимии.

Обычно используют два  термина - генетическая и генная инженерия. Первый из них используется в более широком смысле, т.е. в него входит и понятие генной инженерии. При этом к последней не относятся перестройки генома обычными генетическими методами (мутациями и рекомбинациями).

Рассмотрим основные генноинженерные  подходы, которые в перспективе  могут быть использованы в животноводстве. Известно, что генетический материал всех живых организмов сосредоточен в молекулах ДНК. Все клетки организма имеют идентичные копии таких молекул.

Поэтому основой  проведения генноинженерных исследований является именно молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты. При этом придерживаются такой  последовательности: сначала выделяют гены из отдельных клеток или синтезируют их вне организма, потом включают новые гены в вектор (молекула ДНК, имеющая собственный аппарат репликации и способная поставлять в клетку необходимые гены и реплицировать их), соединяют ДНК гена и вектора и получают рекомбинантную ДНК; потом переносят определенные гены в геном хозяина, проводят их клонирование в составе вектора и получают генный продукт путем экспрессии чужеродного гена в реципиентной клетке.

Известны два  способа выделения генов и создания рекомбинантной ДНК. Первый — с помощью химического синтеза, второй, более распространенный, с помощью особых ферментов (рестриктаз), которые имеют способность распознавать чужеродную ДНК, проникающую в организм и расщеплять ее в соответствующих участках. В результате создаются фрагменты разнообразных размеров подлине. Известны более 500 рестриктаз и каждая специфически расщепляет ДНК. Они лишены всякой видовой специфичности. Благодаря этому можно объединять в одно целое фрагменты ДНК любого происхождения и преодолевать природные видовые барьеры.

Части и разрывы  нитей ДНК склеивают с помощью  фермента лигазы. Особенностью выделенных генов (нуклеотидов) являются так называемые липкие концы, которыми их можно присоединить к участкам фагов (для животных). Таким образом, создается вектор для переноса выделенных генов в клетку-реципиент.

Известен другой путь получения фрагментов ДНК с  липкими концами. Для этого выделенные или искусственно синтезированные  участки ДНК обрабатывают ферментом  эндонуклеазой, которая укорачивает ее с обоих концов. Потом с помощью другого фермента — полинуклеотидтрансферазы достраивают к этим концам участки адениновых и тимидиновых нуклеотидов. Полученную молекулу рекомбинированной ДНК используют для переноса чужеродного гена в бактермальную клетку. Такая схема была использована для генов инсулина, интерферона, иммуноглобулина и других.

Необходимо заметить, что наличие и даже введение гена в хромосому организма-хозяина  еще не дает возможность получать продукты его синтеза. Для того чтобы ген мог функционировать, он должен наряду с участком, где закодирована информация, иметь еще регуляторный участок. Эти участки называются, соответственно, промотором и терминатором. С промотора начинается считывание информации (транскрипция), а в терминаторе закодировано окончание транскрипции сданного гена. Создан целый арсенал клонированных промоторов, которые дают возможность обеспечить проявление генов в разных типах клеток. При этом такой клон содержит 1-2 гена, и если учесть, что клонов большое число, то практически они представляют все гены, которые есть в геноме животного.

Например, для  создания банка генов кроля необходимо 920 тысяч клонов, млекопитающих — 0,8-1,0 млн. Первый банк генов был создан для кишечной палочки, потом для других, в т.ч. и для крупного рогатого скота. Также были сформированы библиотеки клонов ДНК гипофиза и гормона роста.

Большое значение имело получение интерферона  для человека, белка с универсальным антивирусным действием. Одним из важнейших достижений генной инженерии в практике животноводства является открытие соматотропного гормона (соматотропина или гормона роста). Но еще задолго до этого было известно, что экстракт гипофиза крупного рогатого скота стимулирует молочную продуктивность коров. Рассчитывали с помощью этого препарата быстро повысить надои животных. Но трудно было получать его в больших количествах и попробовали применить для этого метод генной инженерии. С помощью микробного синтеза на основе технологии рекомбинантных ДНК решили эту проблему.

Гормон роста берет участие в процессах стимуляции роста, деятельности молочной железы, влияет на обмен углеводов и липидов. Его инъецируют в составе генноинженерных гормонов, которые созданы для крупного рогатого скота, овец, свиней. Их клонирование осуществляют в клетках кишечной палочки и других микроорганизмов.

Использование этого гормона в скотоводстве при ежедневном введении (или через 2-3 дня) способствует повышению скорости роста молодняка на 10-15 %, удоя молока на 20-40 %. Состав молока при этом не меняется.

Положительные результаты получены в исследованиях  по стимуляции с помощью соматотропина  интенсивности роста свиней, овец, бычков, репродуктивных способностей свиней.

Вместе с этим не менее сложным заданием является перенос генов непосредственно  высшим организмам, в том числе и животным. Необходимо природным путем, а не введением искусственных препаратов, внедрять новые гены в организмы. Используют несколько подходов — интродукцию гена в изолированные клетки реципиента с последующей ретрансплантацией этих клеток, инъекцию гена непосредственно в организм реципиента, интродукцию клонированных генов в геном эмбрионов на ранних стадиях развития.

Широко проводятся исследования по созданию трансгенных  кролей, овец, свиней, птицы. Быстрыми темпами  осуществляется создание трансгенных животных, которые могут синтезировать некоторые лекарственные препараты; инсулин, интерферон, факторы оседания клеток крови, гормоны, незаменимые аминокислоты. Планируется получение трансгенных овец, которые бы продуцировали в молоке фактор оседания крови, необходимый для лечения гемофилии, причем для этого достаточно стада в 15-20 овец.

Большой интерес  представляют работы по созданию трансгенных  животных, которые синтезируют незаменимые  аминокислоты. Например, в овцеводстве  имеет актуальность способность овец синтезировать метионин, который необходим для роста шерсти. В Австралии удалось получить трансгенное животное с интегрированным гормоном роста овцы. Для этого был выделен ген гормона роста, который потом был введен в геном зиготы. Полученная трансгенная овца в трехлетнем возрасте была в полтора раза больше по живой массе, чем сверстницы.

Получение трансгенных  особей проводится в трех направлениях; картирование геномов сельскохозяйственных животных, производство дополнительных продуктов эндогенного происхождения, использование их для селекционно-генетического улучшения, акклиматизации и одомашнивания.

Наиболее применимым может быть создание линий трансгенных  животных, имеющих ген соматотропина  или устойчивых к целому ряду заболеваний (генетически иммунных форм).

В перспективе  есть возможность получать политрансгенных  животных, в зиготу которых будет  вноситься несколько генов. Но при  этом возникает опасность разрушения эволюционно сбалансированного  генома особей. Поэтому в данном случае одним из основных этапов будет тщательный отбор и селекция на гомеостаз генома политрансгенных животных. Можно наметить несколько направлений применения генной инженерии для создания трансгенных животных по видам.

Крупный рогатый  скот – трансгенозгормонароста, гена тимидинкиназы вируса герпеса, получение инсулина человека, интерферона, факторов оседания крови, введение гена азотфиксации, ресинтез дикого тура.

Свиньи —  ген гормона роста человека, бычий  ген соматотропина, ген антигена гепатита В, гены релизинггормона, гибридизация с овцой, получение каракульских поросят, гены долголетия.

Овцы — ген  гормона роста овцы, гены синтеза  серосодержащих аминокислот, ген синтеза  протромбина, ген зимней спячки, ген  разноцветной шерсти за счет перенесения  генов попугая.

Птица — ген  инсулин-подобного ростового фактора, ген иммуноглобулина, гены устойчивости против лейкоза, болезни Марека, саркомы  Рауса, гормон роста птицы, генантисмысловой ДНК аденовируса, мини-гуси, гены устойчивости от болезней от диких родственников, гены яйцеживорождения.